微小RNA-208b在糖尿病性心肌纖維化中的作用研究.pdf

1、糖尿病性心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者常見的心血管并發(fā)癥,它獨立于高血壓性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心臟瓣膜病及其他心臟病變的心肌疾病。心肌纖維化(Myocardial fibrosis,MF)是引發(fā)DCM的最主要原因之一,而糖尿病性心肌纖維化(Diabetic myocardial fibrosis)的發(fā)生機制尚不明確。近年來,微小RNA(microRNA,miRNA)在基因表達調(diào)

2、控中的作用越來越引起人們的重視。miRNA廣泛存在于動植物中,參與細胞增殖、分化、凋亡、胚胎發(fā)育、形態(tài)建成以及一系列疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。已有研究顯示,miRNAs參與了心肌纖維化的過程。本文將對糖尿病性心肌中miRNAs表達譜進行分析,篩選表達變化顯著的miRNAs,研究其在糖尿病性心肌纖維化中的可能作用,為進行基于microRNAs的心肌纖維化治療研究提供科學依據(jù)。
　　目的：利用II型糖尿病db/db小鼠和db/m對照小鼠,

3、新生乳C57BL/6小鼠心肌細胞,檢測db/db和db/m小鼠心肌組織中miRNA表達譜變化,篩選顯著上調(diào)的miRNA做進一步功能研究,試圖揭示其在糖尿病性心肌纖維中的作用機制。
　　方法：(1)利用16周齡雄性II型糖尿病模型db/db小鼠和db/m對照小鼠,檢測外周血血糖和胰島素水平,進行葡萄糖耐量和胰島素耐量實驗,利用小動物B超檢測其心臟結構和功能狀況。
　　(2)利用miRNAs表達譜芯片,檢測db/db及db/m小

4、鼠心肌組織中miRNAs表達變化,利用熒光實時定量PCR(qPCR)鑒定差異表達的miRNAs。
　　(3)利用差速貼壁法分離出生1d~3d的乳C57BL/6小鼠心肌細胞和心肌成纖維細胞,利用傳至第3代的心肌成纖維細胞進行細胞學實驗。
　　(4)利用Masson染色、qPCR、Western blot等方法檢測心肌組織中膠原水平及纖維化相關基因Col1a1、Col3a1、TGF-β1、CTGF、α-SMA等的表達。
　

5、　(5)利用AngⅡ、TGF-β1和高糖/葡萄糖氧化酶(G/GO)處理心肌細胞和心肌成纖維細胞,檢測miR-208b的表達變化。
　　(6)分別利用miR-208b模擬物(mimic)和抑制物(inhibitor)轉(zhuǎn)染心肌成纖維細胞,用qPCR、Western blot方法檢測纖維化相關基因Col1a1、Col3a1、α-SMA等的表達。
　　(7)分別利用雙熒光報告基因系統(tǒng)檢測miR-208b與候選靶基因Mtf2、Pgrm

6、c1的3’UTR的結合能力。對比miR-208b mimic,研究Mtf2 siRNA、Pgrmc1 siRNA修飾的小鼠心肌成纖維細胞中纖維化相關基因的表達情況。
　　(8)研究調(diào)控糖尿病條件下小鼠心肌成纖維細胞中miR-208b表達的信號通路。
　　結果：(1)小動物心臟B超結果顯示,對比db/m小鼠,db/db小鼠心臟左室出現(xiàn)收縮、舒張功能障礙和心室結構改變。
　　(2)Masson染色結果顯示,db/db小鼠心

7、肌細胞間質(zhì)和微血管周圍膠原沉積顯著增加,db/db小鼠心肌中Col1a1、Col3a1、CTGF等纖維化相關基因的表達顯著上調(diào)。
　　(3)Western blot檢測發(fā)現(xiàn),磷酸化Smad3水平在db/db小鼠心肌組織中顯著升高,Smad3信號通路處于激活狀態(tài)。
　　(4)microRNA表達譜芯片結果顯示,對照db/m小鼠,db/db小鼠心肌中多個miRNAs出現(xiàn)差異性表達,經(jīng)qPCR驗證,其中明顯下調(diào)的miRNA有l(wèi)et

8、-7g、miR-142、miR-29b、miR-30e等,而miR-208b在db/db小鼠心肌組織中表達升高最顯著。
　　(5)在細胞水平,利用AngⅡ、TGF-β1和高糖/葡萄糖氧化酶(G/GO)處理小鼠心肌細胞和心肌成纖維細胞,發(fā)現(xiàn)miR-208b表達均呈劑量依賴性升高。
　　(6)采用miR-208b mimic處理乳小鼠心肌成纖維細胞,發(fā)現(xiàn)miR-208b可特異上調(diào)Col1a1、α-SMA及CTGF的表達。

9、　　(7)雙熒光報告基因系統(tǒng)檢測結果表明,miR-208b可抑制候選靶基因Mtf2和Pgrmc1的表達。利用siRNA分別沉默心肌成纖維細胞中Mtf2和Pgrmc1表達后,發(fā)現(xiàn)纖維化相關基因表達增加,與miR-208b mimic作用效果一致。
　　(8)AngⅡ、TGF-β1可激活心肌成纖維細胞中Smad3信號通路上調(diào)miR-208b表達,而抑制Smad3可降低miR-208b表達。
　　結論：(1)發(fā)生纖維化的16周齡糖

10、尿病db/db小鼠心肌中出現(xiàn)miRNAs的差異性表達變化。miR-208b在db/db小鼠心肌中表達顯著升高,而在細胞水平上,AngⅡ、TGF-β1和G/GO均可誘導心肌細胞和心肌成纖維細胞中miR-208b表達升高。
　　(2)熒光定量PCR和Western blot檢測證實,miR-208b mimic可特異上調(diào)心肌成纖維細胞中Col1a1、Col3a1、CTGF等纖維化相關基因的表達,而miR-208b inhibitor的