Akt1對PMS2蛋白的靶向調(diào)節(jié)作用及卵巢癌鉑類耐藥的機制研究.pdf

1、第一部分Akt1,P-AktS473和PMS2在不同腫瘤細胞株中的表達及相關性
　　目的
　　檢測Akt1,P-AktS473和PMS2蛋白在人類不同腫瘤細胞株:A2780,Caov3,C13K,ES2,HO8910,OV2008,A875,A549,ACHN,Lovo,SW480和MCF-7中的表達及相關性。
　　方法
　　1.WesternBlot檢測Akt1,P-AktS473和PMS2蛋白在A2780,C

2、aov3,C13K,ES2,HO8910,OV2008,A875,A549,ACHN,Lovo,SW480和MCF-7中的表達水平。
　　2.Akt1激動劑IGF-1活化其活性后,WesternBlot檢測Akt1,P-AktS473和PMS2蛋白在A875,ES2和Caov3細胞中表達水平改變情況。
　　3.Akt1特異性抑制劑API-2和AktInhibitorI,抑制Akt1活性后,WesternBlot檢測Akt1,

3、P-AktS473和PMS2蛋白在OV2008和A2780細胞中表達水平改變情況。
　　4.應用siRNA干擾Akt1基因的表達水平后,實時定量PCR檢測Akt1及PMS2mRNA在A2780細胞中的變化情況;WesternBlot檢測Akt1,P-AktS473和PMS2蛋白在A2780細胞中表達水平改變情況。
　　結果
　　1.Akt1,P-AktS473和PMS2三種蛋白在13株細胞內(nèi)均有表達,但表達平高低不一:

4、在C13K,Caov3,ES2,HO8910,Lovo,ACHN和A875細胞株中PMS2蛋白高水平表達,同時Akt1的活化形式P-AktS473蛋白處于低表達水平,其中ES2細胞株中P-AktS473蛋白表達缺失;在A2780,OV2008,SW480和A549細胞中,PMS2蛋白表達水平低,但伴隨著高水平的P-AktS473蛋白表達;在Hela和MCF-7細胞株中P-AktS473和PMS2蛋白均有高水平表達。即Akt1的活化形式P

5、-AktS473與PMS2蛋白表達呈負相關。
　　2.應用Akt1激動劑IGF-1上調(diào)Akt1的活性后,腫瘤細胞株A875,ES2和Caov3中PMS2表達水平明顯下降,且與IGF-1的作用存在時間依賴性。
　　3.應用Akt1的特異性抑制劑API-2和AktInhibitor-1抑制Akt1的活性后,腫瘤細胞株A2780和OV2008中PMS2表達水平明顯升高,且與API-2和AktInhibitor-1的作用存在時間依賴

6、性。
　　4.應用siRNA抑制Akt1基因mRNA表達水平后,A2780細胞中活化Akt1蛋白表達明顯下降,但PMS2mRNA表達水平無明顯變化的情況下伴隨PMS2蛋白表達水平明顯增高。
　　結論
　　不同的腫瘤細胞株中,PMS2蛋白表達與Akt1的活化形式P-AktS473蛋白的表達呈負相關,PMS2蛋白的表達可能受活化Akt1的調(diào)控。
　　第二部分Akt1對PMS2的靶向調(diào)節(jié)作用的機制研究
　　目的<

7、br>　　探討Akt1是否靶向調(diào)節(jié)PMS2蛋白的表達及其穩(wěn)定性。
　　方法
　　1.直接免疫共沉方法檢測Akt1和PMS2蛋白自然狀態(tài)下是否直接結合。
　　2.建立Akt1-wt+PMS2-wt及Akt1-wt+PMS2-T156A共轉染的穩(wěn)定表達細胞株,檢測外源性的Akt1與PMS2和突變體PMS2蛋白的結合情況。
　　3.API-2特異性抑制Akt1活性后,CHX抑制蛋白合成,檢測PMS2蛋白半衰期變化情況。

8、
　　4.CHX抑制蛋白合成,檢測PMS2-wt和PMS2-T156A穩(wěn)定轉染細胞株中,外源性PMS2蛋白半衰期變化情況。
　　5.應用API-2和siRNA抑制Akt1活性后,細胞免疫熒光觀察PMS2蛋白細胞內(nèi)的分布情況的變化。
　　結果
　　1.在Hela,A875和A2780細胞株中,anti-PMS2抗體可以將Akt1蛋白沉淀下來,同時anti-Akt1抗體沉淀下來的免疫復合物中可以檢測到PMS2蛋白存在

9、。
　　2.Akt1-wt+PMS2-wt質粒共轉染的SW480細胞中,anti-PMS2抗體可沉淀下Akt1蛋白;anti-Akt1抗體可沉淀下PMS2蛋白。共轉染Akt1-wt+PMS2-T156A質粒的SW480細胞中,anti-PMS2抗體沉淀下Akt1蛋白及anti-Akt1抗體沉淀下PMS2蛋白的量明顯下降。
　　3.在Hela,A875和A2780細胞株中,API-2特異性抑制Akt1活性后,PMS2蛋白的半衰

10、期明顯延長。
　　4.在Hela,A875和A2780細胞株中,與PMS2-wt穩(wěn)定轉染細胞相比,PMS2-T156A穩(wěn)定轉染細胞中PMS2蛋白的半衰期明顯延長。
　　5.在Hela及A875細胞中,API-2或siRNA抑制Akt1的活性后,PMS2蛋白從細胞漿轉移至細胞核內(nèi),即出現(xiàn)核移位,主要表達于細胞核內(nèi)。
　　結論
　　Akt1可以直接與PMS2蛋白結合并降低其穩(wěn)定性,且影響PMS2蛋白的亞細胞定位。

11、r>　　第三部分PMS2介導的鉑類所致DNA損傷后的促凋亡作用與卵巢癌耐藥的機制研究
　　目的
　　探討PMS2蛋白是否影響鉑類所致DNA損傷后的凋亡途徑,從而參與卵巢癌鉑類耐藥的發(fā)生。
　　方法
　　1.順鉑處理細胞后,WesternBlot檢測不同PMS2蛋白表達水平的A2780和ES2細胞中P53,P63,P73,Caspase-3和Caspase-9凋亡相關蛋白的變化。
　　2.順鉑處理細胞后,細胞

12、免疫熒光檢測不同PMS2蛋白表達水平的細胞中細胞核的固縮、核碎裂情況。
　　3.流式細胞儀檢測,相同順鉑處理后,不同PMS2蛋白表達水平的細胞凋亡率的變化情況。
　　4.流式細胞儀檢測,相同順鉑處理后,不同PMS2蛋白表達水平的細胞中細胞周期的變化情況。
　　結果
　　1.在卵巢癌細胞株A2780和ES2中,PMS2可誘導順鉑所致DNA損傷后P63的表達明顯增高,且P63蛋白的表達增加與順鉑用量存在劑量依賴性。<

13、br>　　2.細胞免疫熒光檢測顯示,PMS2表達水平高的細胞株中,順鉑所致的細胞核固縮、核碎裂明顯增加。
　　3.PMS2可使順鉑致DNA損傷后的卵巢癌細胞株的凋亡率明顯增高,促進細胞的凋亡作用。
　　4.PMS2可促進順鉑致DNA損傷后的卵巢癌細胞株的G2/M期停滯,促進細胞的凋亡作用。
　　結論
　　PMS2介導的順鉑所致的DNA損傷后的促凋亡作用和細胞周期G2/M期停滯,可能影響卵巢癌細胞對鉑類藥物作用的敏