家蠶β-胸腺素基因的特性研究.pdf

1、胸腺素（Thymo sin）是一種廣泛存在于真核生物體內(nèi)，并廣泛參與了多種生物學(xué)途徑的蛋白分子。目前，關(guān)于胸腺素的研究主要集中在脊椎動物中，而對無脊椎動物胸腺素的研究還不是很廣泛，尤其是針對家蠶胸腺素基因的相關(guān)報道還比較少。
　　本研究通過生物信息學(xué)分析，以及分子克隆的方法得到家蠶中存在的兩種胸腺素基因，并對它們的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了初步探究，進(jìn)行了基因組分析、表達(dá)時相、蛋白的相互作用以及是否促進(jìn)細(xì)胞的增殖與遷移等方面的研究。得到的結(jié)

2、果如下:
　　1、通過生物信息學(xué)的比對發(fā)現(xiàn)家蠶中存在兩種胸腺素基因，分別命名為BmTHY1和BmTHY2（GenBank登錄號分別為:NM_001047021.1，F(xiàn)J602790.1）。BmTHY1和BmTHY2基因相似度極高，兩者分別編碼170、132個氨基酸，蛋白相對分子量分別為21kDa、16kDa，且兩個基因都位于家蠶第23號染色體上。多序列比對表明:家蠶胸腺素蛋白BmTHY1、 BmTHY2與棉鈴蟲（Helicover

3、paarmigera）胸腺素蛋白HaTHY1、HaTHY2（GenBank:ADD21556.1，ADD21557.10）相似度高達(dá)94％。
　　2、為明確BmTHY1、BmTHY2是否源自于同一基因，構(gòu)建跨內(nèi)含子特異性引物。該引物以cDNA為模板可同時克隆到BmTHY1、Bm THY2基因全長序列。利用這對引物在基因組水平上進(jìn)行擴增，結(jié)果證實兩者為同一基因的不同剪切副本，二者為同源異構(gòu)體，主要差別是BmTHY2基因較BmTHY1

4、缺失了第三個外顯子。
　　3、為了了解BmTHY1、BmTHY2基因的生物學(xué)功能，分別構(gòu)建了BmTHY1、BmTHY2蛋白的原核表達(dá)載體，載體攜帶有GST融合標(biāo)簽，并成功在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中成功表達(dá)。用谷胱甘肽層析柱進(jìn)行蛋白純化后，再用凝血因子Factor Xa進(jìn)行柱上消化，得到純化的BmTHY1、BmTHY2蛋白。以BmTHY2為抗原免疫昆明小鼠獲得多克隆抗血清。
　　4、利用多克隆抗血清，在翻譯水平檢測了兩

5、種蛋白的表達(dá)時相及組織分布情況。Western Blot結(jié)果表明:在家蠶整個生活周期，兩種蛋白都有表達(dá)且表達(dá)量逐步升高。在蛹期，BmTHY2的表達(dá)量非常高，推測它可能參與了家蠶的變態(tài)發(fā)育。除血淋巴外，兩者在中腸、精巢、卵巢、頭部中均有分布。此外，在脂肪體中僅有BmTHY1存在。這表明兩者在功能上存在在一定差異。
　　5、在驗證家蠶胸腺素蛋白BmTHY1、BmTHY2是否參與到家蠶細(xì)胞BmN抵抗病毒BmNPV過程中，發(fā)現(xiàn)了在細(xì)胞感染

6、后的不同時間段，細(xì)胞內(nèi)BmTHY1、BmTHY2在表達(dá)量上的差異。研究表明，隨著感染時間的延長，細(xì)胞內(nèi)BmTHY1、BmTHY2表達(dá)量逐漸下降。推測可能是由于病毒與宿主博弈過程中，病毒衣殼蛋白與BmTHY1、BmTHY2競爭結(jié)合G-actin所致。
　　6、體外蛋白相互作用實驗表明:BmTHY1、BmTHY2均能與家蠶中腸的actin、14-3-3以及BmNPV病毒的泛素蛋白發(fā)生互作。
　　7、探究家蠶胸腺素BmTHY1、B