稻瘟病菌Magnaporthe oryzae高效轉(zhuǎn)化文庫(kù)的構(gòu)建.pdf_第1頁(yè)
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1、稻瘟病菌能引起水稻上的一種重要病害-稻瘟病,了解其致病過(guò)程和機(jī)理對(duì)于防治稻瘟病有重要作用。同時(shí),作為絲狀真菌致病機(jī)理與分子生物學(xué)研究的重要模式菌,M.oryzae功能基因的克隆對(duì)于了解其他病原真菌與寄主的互作也具有重要意義?;蛭膸?kù)是克隆基因并研究其功能的重要手段,大容量的基因文庫(kù)結(jié)合有效的轉(zhuǎn)化方法,是通過(guò)表型互補(bǔ)進(jìn)行基因克隆的基礎(chǔ)。特別是條件突變體(如溫度敏感型突變體等),通過(guò)表型互補(bǔ)克隆相關(guān)基因是一種基本的方法。本研究構(gòu)建了稻瘟菌C

2、osmid基因組文庫(kù),為ATMT基因組文庫(kù)的構(gòu)建制備了所需的基因組DNA和處理了載體pBHT2,同時(shí)對(duì)稻瘟病菌電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)行了初步探索,為進(jìn)一步通過(guò)表型互補(bǔ)克隆相關(guān)基因打下了基礎(chǔ)?,F(xiàn)總結(jié)如下: 1)稻瘟病菌cosmid基因組文庫(kù)構(gòu)建采用SuperCos1載體構(gòu)建了稻瘟病菌菌株Guy-11基因組文庫(kù)。利用SDS及蛋白酶K法提取高質(zhì)量基因組DNA,并用4個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶Sau3AI對(duì)基因組進(jìn)行不完全酶切,獲得大小約40kb

3、的基因組片段,連接包裝后,轉(zhuǎn)染XL1-Blue MR細(xì)菌,最終獲得4.0×104個(gè)粘粒克隆,相當(dāng)于每微克基因組DNA約產(chǎn)生105個(gè)粘??寺?,粘??寺』旌嫌?5%甘油中并于-70℃下保存。對(duì)50個(gè)隨機(jī)重組子分析表明,98%的重組子含有外源DNA片段,片段平均大小為40.5kb。按照稻瘟病菌基因組DNA大小為40Mb計(jì)算,庫(kù)容量已高達(dá)31.75。同時(shí),根據(jù)Clarke和Carbon公式N=ln(1-p)/ln(1-f)計(jì)算分析表明,理論上從

4、該文庫(kù)中篩選到任一DNA序列的概率在99.99%以上。對(duì)擴(kuò)增保存后文庫(kù)菌液滴度測(cè)定顯示該文庫(kù)滴度約為4.6×108cfu/ml,而進(jìn)行3次反復(fù)凍融后,其滴度仍可達(dá)4.0×108cfu/ml。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的粘?;蚪M文庫(kù)質(zhì)量比較高,為進(jìn)一步功能基因的篩選分離提供了保障。 2)構(gòu)建稻瘟病菌ATMT庫(kù)所需基因片段的制備及載體的處理要采用pBHT2質(zhì)粒Sau3A1酶切載體構(gòu)建稻瘟病菌基因組文庫(kù),利用SDS及蛋白酶K方法提

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