Tfh細胞及其相關因子Bcl-6和Il-21在CRSwNP病人鼻息肉中的表達和意義的研究.pdf

1、本文主要分兩部分展開研究：
　　第一部分 Tfh細胞相關因子Bcl-6和IL-21在CRSwNP鼻息肉組織中的表達和意義的研究
　　研究目的:
　　鼻竇炎伴鼻息肉(CRSwNP)是慢性鼻竇炎的類型之一，傳統(tǒng)上是一種TH2占主導伴有組織大量嗜酸性細胞浸潤的鼻腔鼻竇粘膜慢性炎癥性疾病。除了大量嗜酸細胞在息肉組織浸潤外，我們還可以看到B細胞在息肉組織的大量活化、聚集以及IgA、IgE在息肉組織的過度產(chǎn)生，這說明局部B細胞聚集

2、及其產(chǎn)生的IgA、IgE在CRSwNP形成過程中發(fā)揮了重要作用。
　　以往研究發(fā)現(xiàn)B淋巴細胞在淋巴組織生發(fā)中心的活化、聚集以及IgA、IgE的產(chǎn)生必須有T淋巴細胞的輔助作用。過去學者一直認為是Th2細胞在T淋巴細胞輔助B淋巴細胞的過程中發(fā)揮了主要作用。但有研究顯示缺乏Th2發(fā)育關鍵因子的老鼠仍然可以形成生發(fā)中心，仍然可以引起T細胞依賴的抗體反應，這就提示Th2細胞可能在B細胞聚集和免疫球蛋白的產(chǎn)生過程中發(fā)揮了有限的作用。
　

3、　濾泡輔助性T細胞（Tfh細胞）是新近發(fā)現(xiàn)的不同于Th1和Th2的CD4+T細胞（輔助性淋巴細胞，Th）的一個亞群。
　　2011年Crotty提出，Tfh是主要負責輔助B細胞產(chǎn)生抗體的T細胞亞群，細胞在生發(fā)中心(GC)是Tfh輔助B細胞的部位，Tfh細胞在生發(fā)中心的形成，選擇高親和力B細胞分化為記憶細胞或漿細胞并分泌大量IgA、IgE等免疫球蛋白，以及維持長時間的體液免疫應答等方面都發(fā)揮著關鍵作用。并提出Bcl-6是控制CD4+

4、T細胞分化為Tfh的關鍵轉(zhuǎn)錄因子。Tfh細胞能夠表達各種不同類型細胞分子，如細胞因子IL-21，趨化因子受體5(CXCR5)，共刺激誘導分子(ICOS)和程序死亡因子1(pd-1)。
　　IL-21是Tfh細胞執(zhí)行效應功能的主要細胞因子，其作用的主要靶細胞是B細胞，在B細胞對T細胞依賴抗原的初始免疫應答、再次免疫應答以及體液免疫長期的維持中都發(fā)揮了主要作用。
　　近期研究發(fā)現(xiàn)Tfh細胞通過細胞因子IL-21在生發(fā)中心通過調(diào)節(jié)

5、B細胞分化成記憶性B細胞和漿細胞，分泌大量IgA、IgE等免疫球蛋白，發(fā)揮調(diào)節(jié)人類機體免疫的功能。
　　目前研究發(fā)現(xiàn)Tfh細胞參與了許多免疫系統(tǒng)及炎癥性疾病的發(fā)生過程，如:支氣管哮喘、自身免疫性肝炎和類風濕性關節(jié)炎等，但Tfh細胞是否參與了CRSwNP的發(fā)病過程并不明確。
　　本研究旨在通過檢測CRSwNP病人鼻息肉組織中Tfh細胞轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和白細胞介素21（IL-21）的表達，及其與CD20（B細胞標志抗原）、Ig

6、A、IgE在鼻息肉中的表達情況的關系，探討Tfh細胞在CRSwNP形成過程中是否發(fā)揮了作用。
　　研究方法:
　　以2013年3月-2014年3月期間就診并行手術治療的22例CRSwNP病人的鼻息肉組織為實驗組。并根據(jù)鼻息肉范圍對病人評分（分別記為1，2，3分）。1分:鼻息肉僅僅在中鼻道內(nèi)部;2分:鼻息肉超出中鼻道但還未達到下鼻甲下緣;3分:鼻息肉超過上述范圍或多發(fā)性鼻息肉。以12例因腦脊液鼻漏、眶壁骨折需手術治療病人的鼻腔

7、、鼻竇粘膜組織為對照組。通過免疫組化檢測實驗組和對照組樣本中Bcl-6+、CD20+（B細胞標志性分化抗原）細胞的表達分布，觀察Tfh細胞和B細胞在鼻息肉組織中的分布情況;Real time PCR(RT-PCR)檢測實驗組和對照組樣本中Bcl-6、IL-21在mRNA水平的表達;Western Blot檢測實驗組和對照組樣本中在蛋白水平Bcl-6的表達;ELISA檢測實驗組和對照組樣本中IL-21、IgA、IgE的表達。然后對所得數(shù)據(jù)

8、進行統(tǒng)計學分析，客觀反映在實驗組和對照組中上述各種因子的表達是否存在差異。
　　研究結果:
　　Bcl-6+細胞廣泛分布于鼻息肉組織的固有層中，與對照組比較，實驗組表達量明顯增高，且3分CRSwNP亞群患者息肉組織中Bcl-6+細胞的表達遠高于2分者，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　不論是在mRNA水平還是在蛋白水平，Bcl-6、IL-21在實驗組中的表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，且在m

9、RNA水平Bcl-6的表達與IL-21表達呈正相關。
　　CD20+細胞（B細胞）廣泛分布于鼻息肉組織的固有層中，與對照組比較，實驗組CD20+細胞、IgA、IgE表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。且在實驗組中發(fā)現(xiàn)了6例CD20+細胞、IgA、IgE表達均明顯增高的具有生發(fā)中心樣結構(G-C like structure)的典型病例。
　　研究結論:
　　Tfh細胞相關因子Bcl-6、IL-21在CRSw

10、NP病人鼻息肉組織中表達明顯高于對照組，提示Tfh細胞可能參與了鼻息肉的形成;CD20+B細胞、IgA、IgE在實驗組病人鼻息肉組織中表達與Tfh細胞同步增高，提示在B細胞增殖、分化和免疫球蛋白的產(chǎn)生過程中可能是Tfh細胞提供了關鍵性輔助作用。
　　第二部分 Tfh細胞在CRSwNP不同亞型鼻息肉組織中流式細胞學研究
　　研究目的:
　　根據(jù)以往臨床經(jīng)驗及先前的研究發(fā)現(xiàn)， CRSwNP病人病情的嚴重程度、手術預后與病人

11、是否伴有組織嗜酸性細胞浸潤、病人是否同時伴有支氣管哮喘以及病人是否為復發(fā)性CRSwNP密切相關，而且我們實驗的第一部已經(jīng)證實Tfh細胞可能通過為B細胞的增殖、分化和免疫球蛋白的產(chǎn)生提供幫助的方式參與了CRSwNP的形成。在此基礎上，我們根據(jù)CRSwNP是否伴有組織嗜酸性細胞浸潤、是否同時伴有支氣管哮喘以及病人是否為復發(fā)性CRSwNP將病人分為不同亞型，并利用流式細胞術分析Tfh細胞在CRSwNP、對照組及其不同亞型鼻息肉組織中的表達，觀

12、察疾病的嚴重程度是否與Tfh細胞的表達情況具有相關性。
　　研究方法:
　　根據(jù)CRSwNP病人鼻息肉組織中是否具有生發(fā)中心樣結構、是否伴有組織嗜酸性細胞浸潤、是否同時伴有支氣管哮喘以及是否為復發(fā)性CRSwNP，將病人分為不同的亞型，CRSwNP鼻息肉組織或正常對照鼻腔鼻竇粘膜經(jīng)勻漿器勻漿后提取上清液。由于Tfh細胞是Th細胞（CD4+T細胞）的一個亞群，Bcl-6是Tfh細胞的關鍵轉(zhuǎn)化因子，所有Bcl6+CD4+T細胞即為

13、Tfh細胞。我們用流式細胞儀分析檢測實驗組和對照組組織提取液中的Bcl6+CD4+細胞（Tfh細胞）占全部CD4+T細胞的比例，用統(tǒng)計學方法進行統(tǒng)計和分析。
　　研究結果:
　　CRSwNP病人鼻息肉組織中Tfh細胞占全部CD4+細胞的比例明顯高于對照組(P＜0.01）;具有生發(fā)中心樣結構(GC+)CRSwNP病人鼻息肉組織中Tfh細胞的比例明顯高于不具有生發(fā)中心樣結構者(P＜0.01）;伴有組織嗜酸性細胞(EOS+)浸潤C

14、RSwNP病人鼻息肉組織中Tfh細胞的比例明顯高于非嗜酸性細胞浸潤者(P＜0.01);同時伴有支氣管哮喘CRSwNP病人(AS+)鼻息肉組織中Tfh細胞的比例明顯高于不伴有哮喘者(P＜0.01）;復發(fā)性CRSwNP病人鼻息肉組織中Tfh細胞的比例明顯高于初發(fā)者(P＜0.01）。
　　研究結論:
　　Tfh細胞在CRSwNP的表達明顯高于對照組，此結果與第一部分實驗結果（Tfh細胞相關因子Bcl-6、IL-21在CRSwNP病

15、人鼻息肉組織中表達明顯高于對照組）相一致，進一步說明了Tfh細胞在CRSwNP發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用;Tfh細胞在具有生發(fā)中心樣結構病人、伴有組織嗜酸性細胞浸潤病人、伴有支氣管哮喘病人以及復發(fā)性CRSwNP病人中的表達高于相應對照組，說明Tfh細胞在鼻息肉組織中表達情況與疾病的嚴重程度密切相關。由于Tfh細胞在不同亞型CRSwNP病人中的表達存在差異，提示Tfh細胞可以作為Tfh細胞病人病情嚴重程度以及手術預后的新的生物學指標，也提示我