基于SF-G和SF-G-HA腎支架材料對(duì)成骨細(xì)胞黏附、增殖及成骨分化影響的對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　外傷、腫瘤、先天畸形等原因所致的頜骨缺損的修復(fù)是頜面及整形外科醫(yī)師面臨的一大難題。傳統(tǒng)的治療手段往往需要犧牲自體骨進(jìn)行移植修復(fù)，容易造成供區(qū)的創(chuàng)傷和功能受限，而異體、異種骨因存在免疫排異反應(yīng)、交叉感染病毒等安全問(wèn)題而受到極大的限制。在過(guò)去的二十幾年中，組織工程化骨作為頜骨缺損修復(fù)的一種替代治療取得了快速發(fā)展。與目前臨床常用的骨移植方法相比，組織工程化骨具有以下優(yōu)點(diǎn):①需要的供體組織少，損傷小;②細(xì)胞可在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，

2、無(wú)抗原性或抗原性甚微;③可根據(jù)修復(fù)缺損需要，利用仿生技術(shù)，將植入物制成精確的三維形狀，為復(fù)雜骨缺損的修復(fù)提供新的途徑;④組織工程化骨具有生命力，是一種活骨移植，可縮短骨缺損的修復(fù)時(shí)間并提高骨缺損的修復(fù)質(zhì)量。骨組織工程同其他組織工程的研究一樣，也主要包括三方面的內(nèi)容，即骨引導(dǎo)生物材料支架;種子細(xì)胞（成骨細(xì)胞）;組織工程化骨組織的構(gòu)建。其中，骨傳導(dǎo)支架的開發(fā)在骨再生治療中起到至關(guān)重要的作用，尤其是大型骨缺損的修復(fù)。支架充當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM

3、)有利于細(xì)胞的黏附、遷移、增殖及分化成有功能的組織，同時(shí)要求支架具有合適的機(jī)械強(qiáng)度和降解速度。由于單一的支架材料不能完全滿足骨支架的各項(xiàng)性能要求，通過(guò)優(yōu)化組合發(fā)展混合骨支架越來(lái)越得到重視，因其能同時(shí)提高機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)胞親和性。鑒于骨支架的細(xì)胞親和性，目前生物相容性良好的蛋白質(zhì)已被用于模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)。蛋白質(zhì)是由精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(GRD)序列組成的生物大分子，可以與細(xì)胞膜受體發(fā)生特異性結(jié)合。在各種蛋白質(zhì)中，明膠和絲素蛋白因其具有

4、良好的生物相容性、生物降解性、無(wú)細(xì)胞毒性及較輕微的炎癥反應(yīng)，已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有價(jià)值的應(yīng)用材料。
　　明膠(Gelatin，G)是膠原的變性分解產(chǎn)物，膠原在生理?xiàng)l件下具有一定的抗原性，明膠則無(wú)抗原性。明膠為水溶性分子，明膠溶液與戊二醛交聯(lián)后形成的水凝膠中的水可以作為致孔劑，經(jīng)冷凍干燥后形成明膠多孔支架。此外，明膠還可以促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖及成骨分化，被廣泛地稱作生物相容性材料。
　　絲素蛋白(Silk Fibrion，SF

5、)是由蠶絲脫膠而得的纖維蛋白質(zhì)，約占天然蠶絲蛋白的70％左右，是一種含18種氨基酸的天然高分子纖維蛋白。絲素蛋白的主要構(gòu)成是甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸，極易形成反平行的β-折疊片層結(jié)構(gòu)，因而絲素蛋白纖維具有良好的熱穩(wěn)定性和機(jī)械性能。絲纖維最早作為手術(shù)縫合線用于生物醫(yī)學(xué)研究中，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，絲素蛋白作為生物材料具有以下優(yōu)點(diǎn):①良好的機(jī)械性能，絲素蛋白的拉伸強(qiáng)度可達(dá)500MPa，彈性模量達(dá)到5-12GPa,完全可以滿足生物材料的各種需要;②加

6、工靈活，可加工成薄膜、支架或其他形式;③可以根據(jù)特定的生物醫(yī)學(xué)用途而進(jìn)行物理改性，例如，納米或微米尺度的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[5]，或化學(xué)改性，包括整合誘導(dǎo)細(xì)胞分化的生長(zhǎng)因子;④化學(xué)結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能可調(diào)，骨再生能力良好;⑤可部分生物降解，在體內(nèi)外降解速率緩慢，降解產(chǎn)物不僅對(duì)組織無(wú)毒副作用，還對(duì)周圍組織有營(yíng)養(yǎng)與修復(fù)作用。由于以上特點(diǎn)，使絲素蛋白在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用研究和重視。目前基于絲素蛋白的支架材料通過(guò)接種間充質(zhì)干細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，成熟內(nèi)

7、皮細(xì)胞與原代成骨細(xì)胞共培養(yǎng)已應(yīng)用于多個(gè)組織工程。此外，有研究表明絲素蛋白通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路能夠刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，可作為一種理想的材料用于骨組織工程。
　　羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)具有與天然骨無(wú)機(jī)礦物質(zhì)相似的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成，良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性及較高的機(jī)械強(qiáng)度，基于以上優(yōu)點(diǎn)，羥基磷灰石支架可用于人體內(nèi)承受壓力較大的部位，是一種理想的骨替代材料。
　　共混法是高分

8、子材料科學(xué)領(lǐng)域中常用的一種材料制備方法。單一聚合物的性能往往不能滿足組織工程的所有需要，可以通過(guò)共混法，使兩種或多種聚合物在性能上相互彌補(bǔ)，以獲得綜合性能更好的材料。
　　本研究目的是采用冷凍干燥法及仿生礦化技術(shù)分別制備三維多孔的SF/G和SF/G/HA骨組織工程復(fù)合支架，并對(duì)其部分理化性能進(jìn)行表征;將人成骨細(xì)胞hFOB1.19分別接種于SF/G和SF/G/HA復(fù)合支架上，在體外構(gòu)建組織工程化骨，體外研究其對(duì)成骨細(xì)胞早期黏附、增殖

9、、成骨分化的影響，評(píng)價(jià)其作為骨組織工程支架的生物相容性，為骨組織工程支架設(shè)計(jì)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、采用冷凍干燥法及仿生礦化技術(shù)分別制備SF/G和SF/G/HA三維多孔的骨支架，運(yùn)用掃描電鏡(SEM)、液體置換法、力學(xué)測(cè)試等方法，對(duì)該兩種支架材料的表面形貌、孔徑大小、孔隙率、溶脹率、力學(xué)強(qiáng)度進(jìn)行表征。
　　2、復(fù)蘇人成骨細(xì)胞hFOB1.19(由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)部提供)，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，倒置相差顯微

10、鏡逐日觀察該細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)、增殖情況并進(jìn)行照相。
　　3、實(shí)驗(yàn)分為3組，即SF/G組、SF/G/HA組和空白對(duì)照組。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人成骨細(xì)胞hFOB1.19分別接種于上述三組中進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算細(xì)胞早期黏附情況、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶試劑盒檢測(cè)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性，分別比較SF/G和SF/G/HA支架材料對(duì)人成骨細(xì)胞hFOB1.19黏附、增殖、成骨分化的影響。
　　結(jié)果：
　　1、

11、SF/G和SF/G/HA骨支架均具有三維多孔結(jié)構(gòu)，孔徑之間相互連通。SF/G支架的孔徑大小在50～350μm左右，平均孔徑大小為270±86μm，孔隙率為84.2％±5.7％，吸水率為286％±11％，溶脹率為11.6％±0.6％，壓縮強(qiáng)度為0.71±0.11MPa，壓縮模量為18.53±3.02MPa; SF/G/HA支架表面及內(nèi)部有較多小的羥基磷灰石晶體沉積，其孔徑大小在50～250μm左右，平均孔徑大小為190±58μm，孔隙率為

12、71.0％±10.9％，吸水率為178％±8％，溶脹率為6.3％±0.5％，壓縮強(qiáng)度為1.14±0.15MPa，壓縮模量為26.19±2.37MPa。
　　2、人成骨細(xì)胞hFOB1.19傳代1小時(shí)后既有細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈球形，6小時(shí)后伸出偽足，24小時(shí)存活細(xì)胞已完全貼壁。貼壁展開后的細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈長(zhǎng)梭形、多角形。
　　3、隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，三組細(xì)胞黏附率均增加，SF/G組和SF/G/HA組的細(xì)胞黏附率均顯著高于空白對(duì)照組，S

13、F/G組的細(xì)胞黏附率顯著高于SF/G/HA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，三組細(xì)胞增殖均增加，培養(yǎng)5d和7d時(shí)，SF/G組和SF/G/HA組的細(xì)胞增殖均顯著高于空白對(duì)照組，培養(yǎng)7d時(shí)，SF/G組的細(xì)胞增殖顯著高于SF/G/HA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，三組細(xì)胞分泌的堿性磷酸酶活性均增加，培養(yǎng)7d和10d時(shí)，SF/G組和SF/G/HA組的細(xì)胞堿性磷酸酶活性均顯著高于空白對(duì)照組，培養(yǎng)1

14、0d時(shí)，SF/G/HA組SF/G組的細(xì)胞堿性磷酸酶活性顯著高于SF/G組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、SF/G和SF/G/HA骨支架材料明顯促進(jìn)人成骨細(xì)胞hFOB1.19的黏附和增殖;SF/G/HA骨支架材料明顯促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化。
　　2、SF/G和SF/G/HA骨支架材料在體外均顯示出良好的生物相容性，然而SF/G/HA骨支架因其良好的機(jī)械性能和成骨性能，在承重頜骨修復(fù)中具有良好的應(yīng)用前