低溫誘導栽培番茄、多毛番茄和類番茄茄的轉錄組分析.pdf

1、有些植物在低溫環(huán)境下能提高自身的耐低溫能力，這個現(xiàn)象稱為低溫馴化，或冷馴化。植物應對低溫環(huán)境的能力是不同的，適應了溫帶環(huán)境的植物能夠在低溫環(huán)境中提高自身的耐低溫能力，而起源于熱帶和亞熱帶環(huán)境的植物（如番茄）不具備耐低溫能力。有研究表明，低溫調控基因在植物低溫應答的分子機制中起到重要的作用，而且不同植物耐受低溫能力的差別很可能與低溫調控基因有關系。此外，也有研究表明，可變剪接(AS)在擬南芥、水稻和玉米等植物中有著廣泛的功能，同時也與這些

2、植物脅迫應答有重要關系。MicroRNA（miRNA，或小RNA）也發(fā)現(xiàn)與植物器官發(fā)育和非生物脅迫應答有關。栽培番茄、多毛番茄和類番茄茄是近緣物種，但它們的耐低溫能力卻有很大的差別，多毛番茄和類番茄茄比栽培番茄具有更強的耐低溫能力，但其耐低溫分子機制目前并不清楚。
　　在本研究中，以栽培番茄（glamor）作為不耐低溫材料的對照，利用轉錄組測序方法，初步解析了多毛番茄(LA1777)和類番茄茄(LA2408)兩種野生番茄的耐低溫分

3、子機制。利用高通量測序儀，我們在三個材料，三個低溫脅迫時間點（0小時、1小時和12小時）中，總共得到了大于200，000，000個測序讀長(Reads)，對這些Reads做了基因組定位，研究了差異表達基因(DEG)、可變剪接(AS)和MicroRNA（miRNA，或小RNA）等信息。我們對沒有基因組參考的多毛番茄和類番茄茄，進行了基因序列的體外從頭組裝，結果分別得到了68，051和59，286個非重復基因片段，且保證所有組裝基因片段的長

4、度都大于200bp。
　　差異表達基因的結果表明，栽培番茄、多毛番茄和類番茄茄這三個材料，在低溫脅迫下，包括1小時和12小時后，都改變了基因的表達模式。在栽培番茄（不耐低溫材料對照）中，受到低溫脅迫1小時和12小時后，分別有1，256和3，350個基因上調（其中804個基因是兩個時間點共有）;有856和3，022個基因下調（其中339個基因是兩個時間點共有）。在多毛番茄中，受到低溫脅迫1小時和12小時后，分別有1，725和2，94

5、0個基因上調（其中722個基因是兩個時間點共有）;有1，967和3，126個基因下調（其中1，000個基因是兩個時間點共有）。在類番茄茄中，受到低溫脅迫1小時和12小時后，分別有617和1，928個基因上調（其中136個基因是兩個時間點共有）;有1，066和1，171個基因下調（其中185個基因是兩個時間點共有）。同時，我們挑選了一些差異表達基因進行熒光定量PCR驗證，證明測序結果可靠，可用于進一步分析。
　　為了研究多毛番茄的耐

6、低溫分子機制，我們利用DAVID分析平臺對多毛番茄和栽培番茄低溫調控基因進行了功能聚類分析。在1小時低溫脅迫后，多毛番茄和栽培番茄低溫調控基因都在“非生物刺激應答”這一類中顯示出高度富集。但是，與栽培番茄相比，多毛番茄低溫調控基因在“葉綠體相關”、“運輸肽”、“三角狀五肽重復”、“苯丙烷代謝過程”、“黃酮代謝過程”和“氨基酸衍生物的生物合成過程”等類別中富集程度更高，而在“細胞壁代謝”、“幾丁質等有機物應答”和“DNA結合的WRKY”等

7、類別中，相比栽培番茄的富集程度更低。在12小時低溫脅迫后，多毛番茄和栽培番茄低溫調控基因都在“有機物應答”和“激素刺激應答”這一類中顯示出高度富集。但是，與栽培番茄相比，多毛番茄低溫調控基因在“UDP-葡糖醛酸基轉移酶”等類別中富集程度更低。數(shù)據(jù)表明，冷耐受型番茄和冷敏感型番茄在低溫應答的分子機制方面存在很大差別。
　　與類番茄茄不同，栽培番茄和多毛番茄與公布的番茄基因組序列相似度都大于70％，我們對其可以進行可變剪接分析。結果表

8、明，在栽培番茄和多毛番茄中，共識別得到172，910個可變剪接，其中包含75，885個新可變剪接。在栽培番茄三個時間點中，分別識別得到105，663、109，251和102，316個可變剪接，其中包含21，548，25，492，22，870個新可變剪接;在多毛番茄三個時間點中，分別識別得到106，690、104，440和105，323個可變剪接，其中包含20，909，19，957和23，179個新可變剪接。其中，發(fā)現(xiàn)內含子保留是可變剪接

9、的主要類型。對低溫脅迫相關的可變剪接進行統(tǒng)計，結果表明，在栽培番茄受到低溫脅迫1小時和12小時后，分別有131和575個可變剪接相應基因傾向于發(fā)生可變剪接;有119和152個可變剪接相應基因不傾向于發(fā)生可變剪接。在多毛番茄受到低溫脅迫1小時和12小時后，分別有114和606個可變剪接相應基因傾向于發(fā)生可變剪接;有122和130個可變剪接相應基因不傾向于發(fā)生可變剪接。同時，在栽培番茄受到低溫脅迫1小時和12小時后，分別有121和522個可

10、變剪接相應基因上調;有110和140個可變剪接相應基因下調。在多毛番茄受到低溫脅迫1小時和12小時后，分別有112和553個可變剪接相應基因上調;有111和122個可變剪接相應基因下調。
　　在本研究中，還識別了總共1，041個MicroRNA（miRNA，小RNA）的候選序列和靶基因。在栽培番茄中，受到低溫脅迫1小時和12小時后，分別有14和8個MicroRNA上調;有7和6個MicroRNA下調。在多毛番茄中，受到低溫脅迫1小

11、時和12小時后，分別有2和4個MicroRNA上調;有5和8個MicroRNA下調。在類番茄茄中，受到低溫脅迫1小時和12小時后，分別有151和59個MicroRNA上調;有151和20個MicroRNA下調。同時，我們識別了MicroRNA的靶基因。根據(jù)MicroRNA與靶基因相反的表達量變化，結果表明，“sly-miR396a-靶基因Solyc07g041640.2”，“sly-miR5303b-靶基因Solyc09g009550.

12、2”，“sly-miR162-靶基因Solyc01g080500.2”，“sly-miR172a-靶基因Solyc03g044300.2”，“unconservative_ SL2.50ch00_3860-靶基因 c50426.graph_c0”，“sly-miR156a-靶基因c49736.graph_c0”等MicroRNA可能是低溫應答相關“MicroRNA-靶基因通路”。結論:基因表達，MicroRNA和可變剪接的差異可能是栽培