雌、雄激素對去卵巢雌鼠淚液分泌及淚腺中Bax，bcl-2表達的影響和淚腺中TGF-β-,1-、MMP-2及其抑制劑TIMP-2表達的實驗研究.pdf

1、眼表（角膜、結(jié)膜、副淚腺和瞼板腺）、主淚腺和它們之間的神經(jīng)放射環(huán)由于其密切的解剖和功能聯(lián)系構(gòu)成一個整體功能單位，稱為“眼表淚腺反饋系統(tǒng)”。它們共同發(fā)揮對淚液分泌和淚膜形成的調(diào)控作用，維護眼表健康，任一環(huán)節(jié)的損害均可導致淚膜完整性和功能的破壞，從而導致干眼。干眼的發(fā)病機制比較復(fù)雜，目前認為主要與炎癥、細胞凋亡、神經(jīng)調(diào)節(jié)機制異常和性激素水平失調(diào)等因素相關(guān)。干眼常發(fā)生于老年女性，性激素被認為是其發(fā)病機制之一。在絕經(jīng)后的婦女，內(nèi)分泌變化是干眼發(fā)

2、生的重要因素，然而是由于雌激素過剩還是不足、雄激素的缺乏和/或雌、雄激素之間的不平衡影響眼表功能尚有爭議，哪些因素起主要作用仍不清楚。
　　 細胞凋亡（apoptosis）是一種特殊的細胞死亡類型，指細胞在一定的生理或者病理條件下，遵循自身固有程序結(jié)束生命的現(xiàn)象。細胞凋亡是一種正常的生理現(xiàn)象，通過凋亡，機體清除感染和損傷，維持機體正常生理功能。然而，在一定條件下，細胞凋亡又是一種病理現(xiàn)象。細胞凋亡受多種信號的協(xié)同調(diào)控，其中最重要

3、的調(diào)節(jié)細胞凋亡的因子是bcl-2和它相關(guān)的基因。細胞凋亡在免疫性疾病中起到十分重要的作用。干眼淚腺和眼表上皮細胞的凋亡異常增加，而局部組織中的淋巴細胞的凋亡卻被抑制。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達受細胞因子、生長因子、性激素、神經(jīng)激素、細胞形態(tài)改變，細胞間交互作用和細胞轉(zhuǎn)化等多種因素的調(diào)節(jié)。已證實性激素在許多組織中調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的合成，全身性和非全身性干燥綜合癥（SS）病人淚液和唾液中MMP-2和MMP-9

4、均增加，在不同的SS鼠模型中也是如此，淚腺炎癥誘導的兔干眼模型淚腺和角膜中MMP-2和MMP-9也同樣升高，認為MMPs可能是本病的發(fā)病機理。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是一類具有多種生物活性的細胞因子，參與調(diào)節(jié)細胞生長、分化等多種功能，是免疫系統(tǒng)的主要抑制性分子。TGF-β1刺激細胞外基質(zhì)（ECM）如膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘蛋白和蛋白多糖的合成，抑制基質(zhì)蛋白酶的產(chǎn)生，促進調(diào)節(jié)各種細胞連接蛋白受體的表達及ECM成分與這些受體的

5、結(jié)合。然而關(guān)于性激素調(diào)節(jié)淚腺中MMP-2及其抑制劑TIMP-2表達，以及與TGF-β1的相互關(guān)系卻不清楚。以往研究表明：17β-雌二醇促進人角膜上皮細胞中促炎細胞因子和MMPs的表達，而MMPs與干眼癥又有非常密切的關(guān)系。近些年，性激素在干眼中的作用逐漸引起人們的重視，成為研究的熱點。
　　 為此本實驗設(shè)計了通過對雌性性成熟Wistar大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)（OVX），模擬人工絕經(jīng)狀態(tài)，給予大鼠雌、雄激素全身及局部治療，觀察血清雌

6、、雄激素水平、淚液分泌量、淚膜穩(wěn)定性、大鼠淚腺和眼表組織學的變化，檢測淚腺中凋亡基因Bax、bcl-2、TGF-β1因子表達及MMP-2及其抑制劑TIMP-2的表達，探討雌、雄激素對去卵巢雌鼠淚液分泌及淚腺功能的影響及其作用機制，為臨床醫(yī)生應(yīng)用雌、雄激素治療絕經(jīng)期婦女干眼提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。本實驗分為三部分。
　　 第一部分雌、雄激素對去卵巢雌鼠淚液分泌及眼表和淚腺組織病理學和超微結(jié)構(gòu)改變的影響
　　 目的：探討雌、

7、雄激素對去卵巢雌鼠淚液分泌及眼表和淚腺組織病理和超微結(jié)構(gòu)改變的影響。
　　 方法：雌性性成熟Wistar大鼠64只，隨機分為正常對照組8只、假手術(shù)組8只、實驗組48只。假手術(shù)組僅打開腹腔，切除部分脂肪，實驗組行雙側(cè)OVX。術(shù)后5個月將實驗組隨機分為實驗1組、實驗2組、實驗3組、實驗4組、實驗5組、實驗6組，每組8只大鼠。自術(shù)后第5個月起，實驗1組不予任何干預(yù)，實驗2組給予粟米油100ul皮下注射每3天一次，實驗3組給予苯甲酸雌二

8、醇200ug/kg皮下注射每3天一次，實驗4組給予苯甲酸雌二醇點眼，每日4次，實驗5組給予3.75mg/kg丙酸睪丸酮肌肉注射每3天一次，實驗6組給予2.5％丙酸睪丸酮點眼，每日4次。分別于術(shù)前、術(shù)后第1、2、3、4、5個月及給藥后6周，測大鼠淚液分泌量（SⅠt）、淚膜破裂時間（BUT）及角膜熒光素鈉染色情況。給藥6周后處死動物，立刻取所有大鼠淚腺、角膜和結(jié)膜，行眼表和淚腺組織病理學和透射電鏡檢查。分別于術(shù)前、術(shù)后第5個月及給藥后6周測

9、大鼠血清雌二醇和睪酮水平。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過OVX模擬人工絕經(jīng)狀態(tài)，去卵巢雌鼠血清中雌、雄激素水平均較術(shù)前降低，淚液分泌減少，淚膜穩(wěn)定性下降。全身補充雄激素使淚液分泌量增加，淚膜穩(wěn)定性提高；全身補充雌激素使淚液分泌量減少，淚膜穩(wěn)定性下降。推測OVX引起的淚液分泌減少與血清雄激素水平下降有關(guān)。
　　 2.全身補充雄激素能夠改善由于OVX術(shù)后出現(xiàn)的淚腺萎縮，緩解眼表損害，促進淚液分泌，改善淚膜穩(wěn)定性。

10、r>　　 3.全身補充雌激素加重淚腺萎縮及眼表損害，減少淚液分泌，破壞淚膜穩(wěn)定性。提醒臨床醫(yī)生應(yīng)慎用激素替代療法。
　　 第二部分雌、雄激素對去卵巢雌鼠淚腺中凋亡基因Bax，bcl-2表達的影響
　　 目的：探討雌、雄激素對去卵巢雌鼠淚腺中凋亡基因Bax、bcl-2表達的影響。
　　 方法：實驗動物及分組同第一部分。給藥6周后處死動物，立刻摘取大鼠淚腺，采用免疫組化（SP法）觀察淚腺上皮細胞凋亡率及凋亡基因Ba

11、x和bcl-2的表達。
　　 結(jié)論：正常大鼠淚腺上皮中存在Bax的表達，OVX術(shù)后淚腺上皮細胞中Bax表達增加，bcl-2表達減少，淚腺上皮細胞凋亡可能是去卵巢雌鼠淚液分泌減少的作用機制之一。全身應(yīng)用雌激素加重去卵巢大鼠淚腺上皮細胞凋亡，全身應(yīng)用雄激素減輕去卵巢大鼠淚腺上皮細胞凋亡。提示雄激素通過改善淚腺上皮細胞凋亡，使淚液分泌量增加，淚膜穩(wěn)定性提高，眼表損害減輕；雌激素與之作用相反。
　　 第三部分雌、雄激素對去卵巢雌

12、鼠淚腺中TGF-β1、MMP-2及其抑制劑TIMP-2表達及其相關(guān)性的實驗研究
　　 目的：探討雌、雄激素對去卵巢雌鼠淚腺中MMP-2及其抑制劑TIMP-2的表達的影響及TGF-β1的表達變化，并對TGF-β1、MMP-2及TIMP-2進行相關(guān)性分析，進一步探討MMP-2及TIMP-2在干眼中的作用機制。
　　 方法：實驗動物及分組同第一部分。給藥6周后處死動物，立刻摘取大鼠淚腺，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測MMP-2mRN

13、A和TIMP-2mRNA水平，采用Western-blot方法檢測淚腺中MMP-2蛋白含量的變化，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測淚腺中TGF-β1的質(zhì)量濃度。
　　 結(jié)論：
　　 1.OVX術(shù)后淚腺中MMP-2mRNA和TIMP-2mRNA水平較正常組增加；雌激素上調(diào)淚腺中MMP-2mRNA和TIMP-2mRNA水平；雄激素下調(diào)淚腺中MMP-2mRNA和TIMP-2mRNA水平；且MMP-2與TIMP-2間有相關(guān)

14、關(guān)系。
　　 2.OVX術(shù)后淚腺中MMP-2蛋白的表達較正常組增加；雌激素上調(diào)淚腺中MMP-2蛋白的表達；雄激素下調(diào)淚腺中MMP-2蛋白的表達。
　　 3.雄激素促進去卵巢雌鼠淚腺中TGF-β1的表達。
　　 4.推測雌激素通過上調(diào)淚腺中MMP-2的水平導致淚液分泌減少，淚膜穩(wěn)定性下降，雄激素與之作用相反，一方面通過增加TGF-β1的含量，抑制淚腺的免疫反應(yīng)，另一方面，通過抑制MMP-2的表達，改善干眼的淚液分泌