miRNA-124靶向調(diào)控PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖和侵潤.pdf

1、背景和目的:
　　目前，腫瘤是危險人類生命健康的頭等殺手。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是星形細(xì)胞腫瘤中惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，屬于WHOⅣ級，是一種最常見最致命的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一，年發(fā)生率為4.96/100，000，占所有膠質(zhì)瘤里面的50％。目前的傳統(tǒng)性的治療手段包括外科手術(shù)、放療和化療以及其它綜合性的治療。雖然過去對于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存率依然很低。由于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤存在于大腦皮層的白質(zhì)這種特殊的位

2、置，并且由于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長速度快、侵潤性強(qiáng)，因此患者病程短，平均存活周期只有大約15個月左右，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者經(jīng)診斷后大約95％未經(jīng)治療的患者生存期不超過3個月。因此，發(fā)展更有效的診斷和治療手段對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)行治療刻不容緩。過去大量的研究表明，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展和一個復(fù)雜的過程，主要涉及到細(xì)胞內(nèi)部原癌基因或者抑癌基因的表達(dá)失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號通路調(diào)控的異常激活或者失調(diào)。因而，進(jìn)一步闡明在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)

3、制將對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的診斷、預(yù)防和治療就顯得非常重要。盡管過去對于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在分子水平上的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了大量研究并取得了很多成果，但是對于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的具體分子發(fā)生機(jī)制仍然大部分不為人知。
　　MicroRNA是一類非編碼的小分子單鏈RNA，Lee等于1993年首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)microRNA，并發(fā)現(xiàn)其參與了對新秀麗線蟲的胚胎后發(fā)育的調(diào)節(jié)。后來在多種物種包括動物，植物中都發(fā)現(xiàn)了microRNA的存在。人類中也發(fā)現(xiàn)了多達(dá)400多種m

4、icroRNA的存在，據(jù)估計可能在人類中存在多達(dá)1000種的microRNA。MicroRNA通過與靶基因mRNA序列的3'非翻譯區(qū)或者編碼區(qū)內(nèi)含子區(qū)域的特異結(jié)合，影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性，或者可以直接抑制靶基因的蛋白翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。累積的研究表明，MicroRNA作為一種重要的調(diào)節(jié)因子，參與了對細(xì)胞分化、增殖、凋亡和代謝等生理過程。由于microRNA對于正常細(xì)胞生理活動調(diào)節(jié)的重要性，一旦microRNA的調(diào)節(jié)失控將引起

5、一系列的分子事件，導(dǎo)致正常細(xì)胞細(xì)胞周期、增殖、轉(zhuǎn)移和侵潤等生物學(xué)行為改變，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤的生成和發(fā)展。因此通過microRNA干預(yù)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生以及增殖將成為未來治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一種新的策略。
　　MicroRNA-124是一個在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)很豐富的miRNA，參與了對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，代謝等重要的生理過程的調(diào)節(jié)。在本文的研究中，為了確定microRNA-124在調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分化和增殖、侵潤過程中的作用，首先通

6、過比較分析microRNA-124在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和正常腦組織的表達(dá)差異，然后通過生物信息學(xué)對microRNA-124在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中潛在的靶基因進(jìn)行了分析，并進(jìn)一步分析了microRNA-124以及靶基因PPP1R13L對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化和增殖的調(diào)節(jié)。
　　方法和結(jié)果:
　　1.microRNA-124在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)顯著下降:通過實(shí)時定量Real-time PCR方法，我們檢測了9例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織以

7、及7組癌旁腦組織中microRNA-124的表達(dá)水平，結(jié)果表明，與癌旁腦組織相比，microRNA-124在這9例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)都顯著性的下調(diào)，下降幅度基本上都達(dá)到幾乎3.5倍，說明microRNA-124在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)顯著下降了。
　　2.microRNA-124負(fù)調(diào)控了靶基因PPP1R13L的表達(dá):通過采用生物信息學(xué)軟件TargetScan對PPP1R13L基因mRNA的3，非翻譯區(qū)進(jìn)行了潛在microRN

8、A結(jié)合位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)PPP1R13L基因mRNA的3'非翻譯區(qū)存在兩個microRNA-124結(jié)合位點(diǎn)，其中一個位點(diǎn)位于人PPP1R13L基因mRNA的3'非翻譯區(qū)下游約180bp處，在多個物種之間都存在高度保守性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證microRNA-124能否直接調(diào)節(jié)PPP1R13L基因，我們構(gòu)建了包含PPP1R13L3，非翻譯區(qū)野生型全長序列、保守結(jié)合位點(diǎn)突變序列突變體的熒光素酶報告基因載體。通過熒光素酶報告基因檢測實(shí)驗(yàn)證明了，micr

9、oRNA-124能夠顯著的抑制包含PPP1R13L3'非翻譯區(qū)野生型全長序列的報告基因的表達(dá)，但是對包含保守結(jié)合位點(diǎn)突變序列突變型載體的報告基因的表達(dá)沒有影響。通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明了，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251和U373細(xì)胞系中，microRNA-124能夠顯著的抑制PPP1 R13L的mRNA水平。進(jìn)一步通過Western blot實(shí)驗(yàn)證明了，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251和U373細(xì)胞系中，microRNA-124能夠顯著的抑制

10、PPP1R13L的蛋白水平。以上的結(jié)果說明，PPP1R13L作為microRNA-124的直接靶基因，被其負(fù)調(diào)控。
　　3.microRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖:通過MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)相比于過表達(dá)對照組，過表達(dá)microRNA-124能夠極大的降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U373的增殖，而過表達(dá)microRNA-124抑制物能顯著的增加膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U373的增殖。說明m

11、icroRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖。
　　4.microRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn):通過流式細(xì)胞技術(shù)，發(fā)現(xiàn)相比于對照組，過表達(dá)microRNA-124能夠極大的抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U373的細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期，而過表達(dá)microRNA-124抑制物能顯著的促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U373的細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期。說明microRNA

12、-124靶向PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期。
　　5.microRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵潤:通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)相比于對照組，過表達(dá)microRNA-124能夠極大的抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U373的侵潤，而過表達(dá)microRNA-124抑制物能顯著的促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U373的侵潤。同時，也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)microRNA-124抑制了

13、U251和U373細(xì)胞中的MMP-9和MMP-13的表達(dá)，過表達(dá)microRNA-124抑制物促進(jìn)了U251和U373細(xì)胞中的MMP-9和MMP-13的表達(dá)。說明microRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵潤。
　　主要創(chuàng)新點(diǎn):
　　1.首次通過Real-Time PCR證明了microRNA-124在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中低表達(dá)。進(jìn)一步提示microRNA-124作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的診斷標(biāo)記物。
　

14、　2.首次證明microRNA-124通過靶向PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長、增殖和遷移。進(jìn)一步證明了microRNA-124可作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的干預(yù)治療靶點(diǎn)。
　　結(jié)論:
　　本研究證明了microRNA-124在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中低表達(dá)，并且證明了PPP1R13L為microRNA-124負(fù)調(diào)節(jié)的靶基因，進(jìn)而闡明了micorRNA-124通過靶向調(diào)節(jié)PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長、增殖和侵襲的分子機(jī)制