五氯酚對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性及內(nèi)分泌干擾作用機(jī)制初探.pdf

1、近年來，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Environmental endocrine disruptors，EEDs)對(duì)人類的危害日益引起公眾和學(xué)術(shù)界的重視，在國(guó)際上已經(jīng)成為毒理學(xué)界的研究熱點(diǎn)。五氯酚(Pentachlorophenol，PCP)對(duì)水生生物的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖構(gòu)成威脅，破壞了水生生態(tài)系統(tǒng)，并通過食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人體健康有潛在的危害。因此在細(xì)胞水平上利用多個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)研究PCP對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)具有重要的意義。到目前為止，PCP的內(nèi)分泌干

2、擾作用的具體機(jī)制還不清楚。雌激素受體(ER)有兩種亞型：ERα和ERβ，PCP是通過ERα或ERβ其中一條途徑還是通過這兩條途徑來行使內(nèi)分泌干擾作用至今未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究PCP是否通過與ERα結(jié)合來行使內(nèi)分泌干擾作用，為進(jìn)一步闡述PCP內(nèi)分泌干擾作用的具體機(jī)制奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)分為兩大部分：
　　 第一部分：通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞DNA損傷以及乳酸脫氫酶(LDH)漏出率、細(xì)胞培養(yǎng)液SOD活性變化多項(xiàng)評(píng)價(jià)指

3、標(biāo)研究了PCP對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性效應(yīng)。
　　 通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，初步確定在10-5mol/L PCP開始對(duì)HeLa細(xì)胞的形態(tài)學(xué)產(chǎn)生影響；然后確定細(xì)胞接種的數(shù)目在6000～10000個(gè)/孔時(shí)，可以很好地反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)；利用MTT比色法測(cè)定PCP對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制率的影響，確定了PCP半數(shù)抑制濃度IC50為66.59μmol/L，16.47μmol/L PCP染毒HeLa細(xì)胞24 h，細(xì)胞增殖抑制顯著，表明

4、線粒體己受到損傷，并且隨著PCP濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率增大，線粒體的損傷程度愈高。
　　 應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)研究了6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L PCP染毒24 h和36 h對(duì)HeLa細(xì)胞DNA的損傷情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論染毒24 h還是36 h，三個(gè)劑量的PCP均沒有造成HeLa細(xì)胞尾部DNA百分率和尾距的顯著增加，提示PCP對(duì)HeLa細(xì)胞DNA沒有損傷作用。
　　 在4個(gè)染毒H

5、eLa細(xì)胞時(shí)間下(12 h、24 h、36 h、48 h)，12.5μmol/L PCP濃度的細(xì)胞LDH漏出率很低，隨著PCP濃度的增加，細(xì)胞LDH漏出率逐漸增大，各PCP濃度組與12.5μmol/L PCP濃度組間均存在顯著性的差異(p＜0.05)，200μmol/L PCP使細(xì)胞LDH漏出率達(dá)到了90％。25μmol/L的PCP已經(jīng)使HeLa細(xì)胞膜受到顯著性損傷，在一定的PCP濃度下(實(shí)驗(yàn)濃度25μmol/L PCP和50μmol/

6、LPCP)，染毒時(shí)間與HeLa細(xì)胞LDH漏出率呈現(xiàn)出一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。LDH漏出率是評(píng)價(jià)PCP對(duì)HeLa細(xì)胞毒性的敏感指標(biāo)之一。
　　 實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)12.25μmol/L、17.5μmol/L和25μmol/L PCP濃度組與溶劑對(duì)照組相比，細(xì)胞培養(yǎng)液SOD活性存在顯著性差異(p＜0.05)，并且隨著PCP濃度的增加SOD活性逐漸下降，存在一定的濃度-效應(yīng)關(guān)系。HeLa細(xì)胞的4個(gè)染毒時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)液SOD活性具有顯著性差異(

7、p＜0.05)，具有一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。相比細(xì)胞LDH漏出率，細(xì)胞培養(yǎng)液SOD活性是評(píng)價(jià)PCP對(duì)HeLa細(xì)胞毒性的更敏感指標(biāo)。
　　 第二部分：通過建立的hERα細(xì)胞篩選系統(tǒng)，初步研究發(fā)現(xiàn)PCP是一種具有弱雌激素活性的內(nèi)分泌干擾物，PCP可以通過ERα結(jié)合形成配體-受體復(fù)合物，發(fā)生構(gòu)象改變并同型二聚體化，同型二聚體化的復(fù)合物可以和DNA分子上的雌激素反應(yīng)元件(ERE)結(jié)合，激活受ERE調(diào)控的熒光素酶基因，熒光素酶基因轉(zhuǎn)錄形成m

8、RNA，mRNA進(jìn)一步翻譯為熒光素酶(Luciferase，Luc)，通過測(cè)定熒光素酶活性可以間接反映PCP的內(nèi)分泌干擾作用。PCP可以和17β-乙炔雌二醇(17β-ethinylestradiol，EE2)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ERα，PCP濃度越大競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ERα的能力越強(qiáng)，同時(shí)與EE2共同誘導(dǎo)Luc表達(dá)的水平降低。
　　 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：PCP染毒HeLa細(xì)胞，可以改變細(xì)胞形態(tài)，10-4mol/L PCP造成絕大部分的HeLa細(xì)胞死亡；P