shRNA-mdr1表達(dá)載體構(gòu)建及RNAi逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞癌多藥耐藥.pdf

1、研究背景 肝細(xì)胞肝癌(Hepatocullular carcinoma，HCC)的是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病呈逐年上升趨勢(shì)，位居我國(guó)惡性腫瘤年死亡率的第二位，嚴(yán)重威脅人民群眾的身體健康。由于HCC的獨(dú)特生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已是中晚期，只有30[％]～40[％]的患者適合根治性手術(shù)，大多數(shù)病人依靠化療或介入化療，而在化療過程中，HCC對(duì)不同結(jié)構(gòu)和功能的化療藥物產(chǎn)生耐受，即多藥耐藥(multidrug resistance，MDR

2、)明顯影響化療的效果。為此，克服HCC的MDR是改善其化療效果的關(guān)鍵。 為了逆轉(zhuǎn)HCC的多藥耐藥性，近年來，各國(guó)的科學(xué)家一直在研究、尋找有效的方法。從最初的P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)抑制劑(拮抗劑)、寡核苷酸技術(shù)、反義RNA技術(shù)到調(diào)節(jié)MDR相關(guān)基因的基因治療，但均存在抑制效率低或特異性不強(qiáng)、插入突變、細(xì)胞毒性等限制，以故未能應(yīng)用于臨床。RNA干擾技術(shù)(RN．Ainterference，RNAi)是近年新

3、發(fā)展的一種基因技術(shù)，其基本原理是內(nèi)源性或外源性雙鏈短．RNA與細(xì)胞內(nèi)切酶形成誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex，RISC)，以siRNA為模板識(shí)別其同源基因mRNA，并對(duì)其進(jìn)行遞進(jìn)式剪切，形成強(qiáng)有效的瀑布效應(yīng)，誘導(dǎo)序列特異的mRNA降解，從而抑制基因表達(dá)。具有特異性強(qiáng)、可遺傳性、可擴(kuò)散性、轉(zhuǎn)錄后抑制等特點(diǎn)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在多種腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)中，siRNA/mdrl表現(xiàn)了很好的逆轉(zhuǎn)效果。

4、目前為止，尚未見RNAi逆轉(zhuǎn)人肝細(xì)胞癌多藥耐藥的體內(nèi)研究報(bào)道，為了探討RNAi技術(shù)能否逆轉(zhuǎn)HCC的MDR，我們課題組在已經(jīng)完成的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了如下的實(shí)驗(yàn)，希望能為改善HCG的化療效果和愈后找到一新的、有效的基因治療措施提供實(shí)驗(yàn)支持和理論依據(jù)。 目的 ①根據(jù)設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)、合成4-5對(duì)siRNA/mdrl，轉(zhuǎn)染耐藥細(xì)胞HepG2/mdrl，從mRN,A、P-gp表達(dá)水平和細(xì)胞功能變化檢測(cè)其逆轉(zhuǎn)效率，從中篩選出1-2對(duì)

5、高效鏈；②用高效siRNA/mdrl鏈構(gòu)建其shRNA/mdrl質(zhì)粒表達(dá)載體pSUPER-shRNA/mdrl，并轉(zhuǎn)染HepG2/mdrl細(xì)胞以進(jìn)一步驗(yàn)證其抑制效率，為體內(nèi)試驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)平臺(tái)；③建立HepG2/mdrl裸鼠移植瘤模型，以shRNA/mdrl-pSUPER進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染，探討RNAi技術(shù)能否逆轉(zhuǎn)動(dòng)物體內(nèi)HCC的MDR，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持。 方法 根據(jù)設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并根據(jù)說明用Silencer si

6、RNA Construction試劑盒(ABIOM公司)合成5對(duì)siRNA(dsRNA)，其中一對(duì)為陰性對(duì)照，復(fù)蘇、培養(yǎng)HepG<,2>/mdr1、HepG2細(xì)胞至90％密度時(shí)，以O(shè)ligofectamine轉(zhuǎn)染試劑將合成的dsRNA分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)mdr1基因的mRNA表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)P-gp表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素積累量，評(píng)價(jià)細(xì)胞耐藥性的變化，從中篩選高效抑制的siRNA/mdr11-2對(duì)；同法

7、培養(yǎng)細(xì)胞，并于HepG2/mdrl細(xì)胞培養(yǎng)液中加入G418和ADM以優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。根據(jù)選出的dsRNA/mdr1，按照質(zhì)粒載體pSUPER設(shè)計(jì)要求，合成長(zhǎng)64bp的寡核苷酸片段(DNA)，溶解后退火形成雙鏈，用BglⅢ和HindⅢ雙酶切pSUPER載體并用膠回收盒回收、純化DNA載體，T4 DNA連接酶連接退火的DNA雙鏈和酶切后的載體，形成重組質(zhì)粒pSUPER-shRNA／mdrl，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，抗生素篩選陽性大腸桿菌克

8、隆，將陽性克隆培養(yǎng)后用PCR驗(yàn)證，PCR產(chǎn)物電泳證實(shí)，將篩選出來的陽性克隆質(zhì)粒pSUPER-mdrl-shRNA送上海生工公司進(jìn)行基因測(cè)序證實(shí)構(gòu)建的質(zhì)粒攜帶的siRNA／mdrl為我們篩選出來的序列。把陽性克隆的大腸桿菌用LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，用上海生工公司去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，質(zhì)粒純化后轉(zhuǎn)染HepG<,2>／mdrl細(xì)胞，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組。新霉素篩選轉(zhuǎn)染后的HepG<,2>／mdrl細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mdrl基因

9、mRNA轉(zhuǎn)錄水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞P-gp的表達(dá)，MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的耐藥性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素(DNR)積累量，評(píng)價(jià)質(zhì)粒載體pSUPER-shRNA-mdrl對(duì)HcpG<,2>／mdrl耐藥性的逆轉(zhuǎn)。建立HepG<,2>／mdrl、HcpG<,2>細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，瘤徑達(dá)0.5cm時(shí)HepG<,2>／mdrl組分為腹腔注射組和瘤體內(nèi)注射組分別經(jīng)腹腔和瘤體內(nèi)注射質(zhì)粒pSUPER-shRNA／mdrl，72h后測(cè)量瘤徑并

10、進(jìn)行阿霉素(ADM)化療實(shí)驗(yàn)，1.5mg／kg，每周2次，共2周，然后處死裸鼠，測(cè)瘤體直徑，瘤體分別制成細(xì)胞懸液和組織切片，流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化分別檢測(cè)P-gp表達(dá)，觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染dsRNA／mdrl對(duì)腫瘤耐藥性的逆轉(zhuǎn)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSSl0.0軟件分析。 結(jié)果 成功合成5條dsRNA／mdrl，并經(jīng)Oligofectamine轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染HcpG<,2>／mdrl細(xì)胞，第四條dsRNA／mdrl-4抑制基

11、因mdrl的mRNA及蛋白P-gP表達(dá)的效果最明顯，P-gP由處理前的79.1±1.6％降至處理后16.84±0.4％(p／m-si-4組細(xì)胞與對(duì)照組HcpG<,2>／mdrl比較，mdrlmRNA表達(dá)水平明顯下降(18.73±1.33％vs 68.03±2.21％，p組比較無顯著差異(18.73±1.33％vs 16.76±O.90％，p>0.05)；細(xì)胞的耐藥性也明顯降

12、低，經(jīng)dsRNA／mdr1-4處理的細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素累積量較其他組細(xì)胞和陰性對(duì)照組細(xì)胞明顯增加，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度達(dá)79.58，陽性率84.25％，篩選出一條具高效抑制的dsRNA，說明體外轉(zhuǎn)錄法適用于篩選高效dsRNA；成功構(gòu)建攜帶高效dsRNA-mdrl的質(zhì)粒載體pSUPER-shRNA／mdrl，經(jīng)測(cè)序證實(shí)與設(shè)計(jì)的序列一致，重組質(zhì)粒能有效轉(zhuǎn)染HepG2／mdrl細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后其耐藥性顯著降低，流式細(xì)胞術(shù)和熒光定量PCR測(cè)定發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和陰性

13、對(duì)照組比較，P-gp表達(dá)率及MDRl基因mRNA水平均有明顯差別(11.0％vs 98.2％，p<0.0l；1.0 vs 56.30，p<0.01)；實(shí)驗(yàn)組HepG2／mdrl對(duì)阿霉素的耐藥倍數(shù)較陰性對(duì)照組明顯下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(15.6 vs 1.64，p<0.05)，相對(duì)抑制效率95.58％；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素累積量與陰性對(duì)照組比較，表現(xiàn)顯著增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(79.32％vs 37.96％，p<0.05)。說明dsRNA

14、／mdrl的質(zhì)粒表達(dá)載體pSUPER-hsRNA／mdrl能穩(wěn)定、有效轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，抑制特定基因的功能，為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)平臺(tái)。成功建立了HepG2／mdrl細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，成瘤率100％；質(zhì)粒載體pSIJPER-hsRNA／mdrl經(jīng)腹腔內(nèi)和瘤體內(nèi)注射均能轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，流式細(xì)胞術(shù)檢查顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞P-gp表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯下調(diào)(65.1％vs 94.1％，p<0.05)，腹腔注射組和瘤內(nèi)注射組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差

15、異(94.1％vs 92.8％，p>0.05)；轉(zhuǎn)染組化療后腫瘤生長(zhǎng)速度較陰性對(duì)照組明顯減慢(700.14±35.61 vs 1659.70±152.54，p<0.05)；瘤體組織病理切片和免疫組織化學(xué)分析也有同樣的結(jié)果，有效逆轉(zhuǎn)腫瘤組織的耐藥性。 結(jié)論 ①體外轉(zhuǎn)錄合成法可以合成高效dsRNA／mdrl，并經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染效率，篩選出有用的dsRNA／mdrl；②雙酶切法能成功構(gòu)建重組表達(dá)載體質(zhì)粒pSUPER-s