復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液對(duì)大鼠肢體缺血-再灌注損傷早期骨骼肌保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液對(duì)大鼠肢體缺血．再灌注骨骼肌損傷保護(hù)機(jī)制的研究。 第一章復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液對(duì)大鼠肢體缺血．再灌注氧化損傷的保護(hù)機(jī)制。 目的：探討復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液對(duì)大鼠肢體缺血．再灌注骨骼肌氧化損傷的保護(hù)機(jī)制。 方法：選用SD雄性大鼠56只，隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組)、缺血再灌注組(IR組)和復(fù)灌Ⅰ號(hào)藥物干預(yù)組(Ⅰ-IR組)三大組。對(duì)照組8只(未造成缺血．再灌注損傷)；缺血．再灌注組24只，再分為再灌注后2

2、h(IR-2)、4h(IR-4)和8h(IR-8)三小組，每小組8只；復(fù)灌Ⅰ號(hào)藥物干預(yù)組24只，再分為再灌注后2h(Ⅰ-IR-2)、4h(Ⅰ-IR-4)和8h(Ⅰ-IR-8)三小組，每小組8只。對(duì)照組所有大鼠用橡皮筋松弛環(huán)繞雙后肢不阻斷血流；IR組和Ⅰ-IR組，按張連元所報(bào)道的方法復(fù)制SD大鼠后肢缺血．再灌注模型。對(duì)照組動(dòng)物不給藥物；IR組于造成缺血前12小時(shí)、造成缺血時(shí)和再灌注時(shí)于腹腔內(nèi)各注射生理鹽水1ml；Ⅰ-IR組于造成缺血前12

3、h、缺血時(shí)和再灌注時(shí)腹腔各注射復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液1ml。各組動(dòng)物于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)切取約1000mg右側(cè)腓腸肌中部肌肉，冰鹽水中快速洗去血液，濾紙吸干水份，剪碎制成勻漿，用于骨骼肌MDA、SOD、MPO的檢測(cè)，另切取部分腓腸肌，固定于福爾馬林溶液中行組織切片檢查，再切取左后肢腓腸肌行干濕重比值的檢查，然后于下腔靜脈穿刺取血，離心，行血清MDA、SOD、MPO、NO檢測(cè)。 結(jié)果：(1)MDA的檢測(cè)結(jié)果：IR與Ⅰ-IR各組MDA含量均較對(duì)照組

4、為高其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且在8h內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高。而復(fù)灌Ⅰ號(hào)干預(yù)各組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均較IR組為低，除骨骼?、?IR-4組與IR-4組相比其差異為P<0.05外，其余各組間比較其P值均小于0.01。(2)SOD的檢測(cè)結(jié)果：IR與Ⅰ-IR各組血清和骨骼肌SOD值均較對(duì)照組為低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在8h內(nèi)其含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。除血清Ⅰ-IR-2組與IR-2組相比其差異為P<0.05外，其余各時(shí)

5、間點(diǎn)Ⅰ-IR組與IR組比較其P值均小于0.01。(3)MPO的檢測(cè)結(jié)果：IR與Ⅰ-IR各組血清和骨骼肌MPO值均較對(duì)照組為高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在8h內(nèi)隨時(shí)間的延長(zhǎng)其含量逐漸升高，而Ⅰ-IR各組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上均較IR組為低，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(4)骨骼肌干濕重的檢測(cè)結(jié)果：IR與Ⅰ-IR各組骨骼肌水腫明顯，8h內(nèi)水腫逐漸增加，與對(duì)照組相比其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而Ⅰ-IR各組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上

6、水腫程度均較IR組為輕，除Ⅰ-IR-2組與IR-2組相比其差異為P<0.05外，其余各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Ⅰ-IR組與IR組間比較其P值均小于0.01。(5)血清NO的檢測(cè)結(jié)果：在再灌注后2h時(shí)為最高，8h內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，IR與Ⅰ-IR各組NO含量均較對(duì)照組為高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而Ⅰ-IR各組較IR組為低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(6)組織切片的檢測(cè)結(jié)果：缺血．再灌注組各時(shí)間點(diǎn)肌肉組織水腫、肌纖維斷裂并

7、有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液可明顯減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，在肌肉細(xì)胞的水腫和肌纖維的損傷方面也有一定的減輕。 小結(jié)： 1．復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液可減少氧自由基的產(chǎn)生。 2．復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液可減輕SOD降低的程度，更有利于機(jī)體清除氧自由基。 3．復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液可降低PMN的游出數(shù)量，同時(shí)減少其在組織中的聚集，降低了炎癥反應(yīng)。 4．復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液可降低血清中NO的含量。 5．復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液可減輕組織

8、水腫程度。 第二章復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液對(duì)大鼠肢體缺血．再灌注損傷骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響研究。 目的：探討復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液對(duì)大鼠肢體缺血．再灌注骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響。 方法：將第一部分所取的部分骨骼肌標(biāo)本進(jìn)行固定、脫水、包埋后切片，采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色，經(jīng)Motic Image advanced 3.1圖像分析系統(tǒng)測(cè)定Bax、Bcl-2蛋白灰度值，然后對(duì)Bax、Bcl-2免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。

9、結(jié)果：骨骼肌組織經(jīng)Bax、Bcl-2免疫組化染色后，高倍鏡下胞漿染色為棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，標(biāo)記強(qiáng)度用灰度值表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)愈強(qiáng)，灰度值愈低。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)(Motic Image advanced 3.1．北京航天航空大學(xué)產(chǎn)品)測(cè)定Bax、Bcl-2蛋白灰度值。(1)Bax免疫組化結(jié)果示：對(duì)照組骨骼肌組織中未見有陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，Bax灰度值為188.50±13.43，在再灌注損傷8h內(nèi)，IR組與Ⅰ-IR組各時(shí)間點(diǎn)灰度值隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降

10、，說明Bax表達(dá)隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，除IR-2組和Ⅰ-IR-2組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各組與對(duì)照組比，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；但Ⅰ-IR各組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上其灰度值均較IR組為高，除2h時(shí)其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余各時(shí)間點(diǎn)其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(2)Bcl-2免疫組化結(jié)果示：對(duì)照組未見陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，Bcl-2灰度值為183.75±8.28，再灌注損傷8h內(nèi)，2h

11、時(shí)表達(dá)最為明顯，其后隨時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)逐漸減弱，灰度值逐漸升高，與對(duì)照組相比，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與IR組相比，Ⅰ-IR組各時(shí)間點(diǎn)的陽(yáng)性表達(dá)均稍高，除2h外，其他各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；(3)Bcl-2/Bax結(jié)果示：再灌注8h內(nèi)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，其比值逐漸增加，說明其細(xì)胞凋亡越來越重，但Ⅰ-IR各組在相同時(shí)間點(diǎn)上較IR各組為低，除2h時(shí)間點(diǎn)外，其他時(shí)間點(diǎn)其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明復(fù)灌Ⅰ

12、號(hào)注射液在缺血．再灌注損傷中有抗骨骼肌細(xì)胞凋亡的作用。 小結(jié)： 復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液可以降低Bax的表達(dá)，升高Bcl-2的表達(dá)，從而減少骨骼肌細(xì)胞凋亡，對(duì)肢體缺血-再灌注損傷的骨骼肌起到一定的保護(hù)作用。 第二部分大鼠肢體缺血-再灌注損傷骨骼肌鈣調(diào)蛋白表達(dá)的變化及復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液對(duì)其影響的研究。 目的：探討大鼠肢體缺血-再灌注損傷骨骼肌鈣調(diào)蛋白表達(dá)的變化以及復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液對(duì)變化的影響。 方法：54只SD大鼠

13、隨機(jī)分為3大組，分別為對(duì)照組(control組)、缺血-再灌注組(IR組)和復(fù)灌Ⅰ號(hào)藥物干預(yù)組(Ⅰ-IR組)。對(duì)照組6只；缺血-再灌注組24只，再分為再灌注后0h(IR-0組)、2h(IR-2組)、4h(IR-4組)和8h(IR-8組)四小組，每小組6只；復(fù)灌Ⅰ號(hào)藥物干預(yù)組24只，再分為再灌注后0h(Ⅰ-IR-0組)、2h(Ⅰ-IR-2組)、4h(Ⅰ-IR-4組)和8h(Ⅰ-IR-8組)四小組，每小組6只。對(duì)照組所有大鼠用橡皮筋松弛環(huán)繞

14、右后肢不阻斷血流；IR組和Ⅰ-IR組，按張連元所報(bào)道的方法復(fù)制SD大鼠右后肢缺血．再灌注模型。對(duì)照組動(dòng)物處死前不給藥物，缺血-再灌注組于造成缺血前12小時(shí)、造成缺血時(shí)和再灌注時(shí)于腹腔內(nèi)各注射生理鹽水1ml；復(fù)灌Ⅰ號(hào)藥物干預(yù)組于造成缺血前12h、缺血時(shí)和再灌注時(shí)腹腔各注射復(fù)灌1號(hào)注射液1ml。各組動(dòng)物于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)在右后肢相應(yīng)區(qū)域內(nèi)剪毛，絡(luò)合碘消毒，于右后肢后內(nèi)側(cè)沿肢體長(zhǎng)軸方向切開皮膚，游離皮膚及皮下組織，剪除深筋膜，切取約1000mg腓腸

15、肌，冰鹽水快速洗去血液，濾紙吸干水份，剪碎制成組織勻漿，用于RyR<,1>和SERCA<,1>的RT-PCR檢測(cè)。 結(jié)果： (1)骨骼肌型RyR<,1>mRNA的RT-PCR結(jié)果：在肢體缺血-再灌注損傷再灌注8h內(nèi)，IR組骨骼肌型RyR<,1>mRNA在再灌注0h、2h表達(dá)上調(diào)，與對(duì)照組相比，其差異有顯著性意義(P<0.01)，4h時(shí)有所恢復(fù)，但8h時(shí)表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組相比，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。復(fù)灌Ⅰ號(hào)注

16、射液干預(yù)組0h稍有增強(qiáng)，增強(qiáng)幅度較IR組為小，與對(duì)照組和IR組相比其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，缺血2h時(shí)其表達(dá)也最強(qiáng)，但要比IR為弱，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，4h時(shí)與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，8h也表現(xiàn)為降低，但降幅要比IR組為小，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)SERCA<,1>mRNA的RT-PCR。 結(jié)果：對(duì)于SERCA<,1>mRNA的表達(dá)，再灌注8h內(nèi)隨時(shí)間的延長(zhǎng)其

17、表達(dá)逐漸下降，與對(duì)照組相比，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。復(fù)灌Ⅰ號(hào)注射液干預(yù)各組的表達(dá)也隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降，但下降幅度較IR組為小，可減緩其下降速度，與IR組相比，除2h時(shí)外，在0h(P<0.05)、4h(P<0.01)、8h(P<0.01)等時(shí)間點(diǎn)其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 小結(jié)： 1．在再灌注8h內(nèi)，肢體缺血-再灌注損傷骨骼肌中RyR<,1>mRNA早期表達(dá)上調(diào)，后期表達(dá)下降，SERCA<,1>mRNA表達(dá)隨時(shí)間的