強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血T細(xì)胞PD-1分子的表達(dá)及意義.pdf

1、目的：
　　 強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是常見的自身免疫性疾病之一，但其發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。盡管大量研究證明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和程序化細(xì)胞凋亡分子（PD-1）在免疫調(diào)節(jié)和維持外周耐受中起著關(guān)鍵作用，但缺乏AS患者PD-1表達(dá)情況在其發(fā)病機(jī)制中的研究。因此，本研究檢測AS患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)情況和PD-1分子在T細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析PD-1.9 C/T基因型對PD-1分子在T細(xì)胞表達(dá)的影響，探討PD-

2、1在疾病發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法：
　　 1.抽取30例初診AS患者和31例健康者的外周血，其外周血一部分是肝素抗凝和另一部分是EDTA抗凝，分別用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　 2.采用流式細(xì)胞儀檢測兩組標(biāo)本外周血T細(xì)胞亞群(CD4+T、CD8+T)及調(diào)節(jié)性細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志（CD4+CD25+、CD4+CD25high和CD4+CD25+CD127low/-T）水平。分析上述3種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞指標(biāo)間的相關(guān)性，進(jìn)一步外周血中

3、CD4+CD25+CD127low/-T調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，與患者急性期的指標(biāo)-血沉(ESR)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)的相關(guān)性。
　　 3.AS患者和健康者外周血經(jīng)植物血凝素(PHA)刺激培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞儀檢測PD-1在不同T細(xì)胞亞群（CD4+T、CD8+T、CD4+CD25+和CD4+CD25high）上的表達(dá)情況。比較培養(yǎng)前后，AS組和對照組T淋巴細(xì)胞亞群上PD-1表達(dá)的變化。
　　 4.提取AS患者外周血DNA，通過R

4、FLP-PCR和基因測序法檢測PD-1.9(rs2227982，7625T/C)位點(diǎn)的基因型，分析AS患者不同PD-1.9基因型對T細(xì)胞PD-1表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.AS組和健康對照組外周血中T細(xì)胞亞群無明顯差異:AS組和健康對照組外周血CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)百分率在兩組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異[(32.63±6.98)％ vs.(33.19±6.38)％，(22.62±5.80)％ vs.(25

5、.99±2.94)％，P均＞0.05]。兩組外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[CD4+CD25+CD127low/-:(6.51±1.51)％ vs.(7.08±1.73)％，P=0.345;CD4+CD25+:(18.73±5.21)％ vs.(18.74±3.41)％，P＞0.05;CD4+CD25high:(4.69±1.32)％ vs.(5.39±1.24)％，P＞0.05]。上述3指標(biāo)相關(guān)性分析表明CD4+CD25hi

6、ghT細(xì)胞與CD4+CD25+CD127low/-T細(xì)胞呈明顯的正相關(guān)性(r1=0.451，P1=0.007); CD4+CD25+T細(xì)胞也與CD4+CD25+CD127low/-T細(xì)胞呈明顯的正相關(guān)性(r2=0.352，P2=0.041)。AS組CD4+CD25+CD127low/-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與兩急性期蛋白水平無相關(guān)性(ESR: r=-0.147，P=0.514; CRP: r=-0.276，P=0.213)。
　　 2.A

7、S組和健康對照組外周血PD-1的表達(dá)情況:
　　 (1)未刺激時(shí)T細(xì)胞亞群的PD-1表達(dá):AS組和健康對照組外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的PD-1表達(dá)率分別為15.7±3.9％和12.0±2.9％，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。兩組CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)率亦無明顯差異[(14.5±5.9)％ vs.（15.5±6.4）％，P＞0.05]。AS組和健康組外周血CD4+CD25high Treg和CD4+CD25+T細(xì)胞上PD-

8、1表達(dá)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異[（0.9±0.5）％vs.（0.8±0.3）％，（15.6±4.2）％vs.（12.2±1.6）％，P均＞0.05]。
　　 (2)經(jīng)刺激培養(yǎng)PD-1差異性表達(dá):外周血經(jīng)PHA刺激24hour后，PD-1在CD4+、CD4+CD25+、CD4+CD25highT細(xì)胞上的表達(dá)百分率和表達(dá)強(qiáng)度在兩組均明顯增加。但AS組CD4+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)率的升高倍數(shù)（經(jīng)PHA刺激后PD-1在各T細(xì)胞上表達(dá)百分率

9、與未刺激時(shí)PD-1百分率的比值）明顯低于健康對照組(1.9-fold vs.3.6-fold，P＜0.05); PD-1在CD4+CD25high T細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞上的升高倍數(shù)，AS組的倍數(shù)明顯低于健康對照組（87.8-fold vs.157.3-fold;9.7-fold vs.17.8-fold，P均＜0.05）。但CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1在兩組間的表達(dá)率的升高倍數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(2.1-fold vs.1.9-

10、fold，P＞0.05)。
　　 3.PD-1.9CT基因型對不同T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)影響情況:外周血經(jīng)PHA刺激后，在AS疾病組中未發(fā)現(xiàn)PD-1.9CC、PD-1.9CT和PD-1.9TT三種基因型在CD4+、CD4+CD25+和CD4+CD25high細(xì)胞上PD-1的表達(dá)倍數(shù)存在明顯差異(F=2.259, P=0.151; F=0.116, P=0.892; F=1.720, P=0.233)。
　　 結(jié)論：

11、>　　 1.本研究未發(fā)現(xiàn)AS患者外周血T細(xì)胞亞群的失衡和CD4+CD25+CD127low/-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)率異常。因此，難以通過外周血T細(xì)胞和CD4+CD25+CD127low/-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量診斷和評估AS的發(fā)病。
　　 2.AS疾病中發(fā)現(xiàn)PD-1分子在不同T細(xì)胞（CD4+、CD4+CD25+、CD4+CD25high）上異常表達(dá)，這暗示了PD-1可能參與AS疾病的發(fā)生與發(fā)展。
　　 3.PD-1.9CT基