低濃度臭氧暴露誘導(dǎo)大鼠氣道炎癥啟動(dòng)的初步研究.pdf

1、臭氧(O3，ozone)是光化學(xué)煙霧的主要成分，是空氣中的氮氧化物(NOx)、一氧化碳(CO)及烴類化合物在紫外線的作用下發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的二次污染物。O3是一種化學(xué)性質(zhì)十分活潑的刺激性氣體，具有強(qiáng)氧化性、自由基形成和生物效應(yīng)的雙向性等特征。近幾十年來(lái)，由于汽車尾氣大量排放，氧化型空氣污染物在不少大中城市呈上升趨勢(shì)。這已成為發(fā)展中國(guó)家和發(fā)達(dá)國(guó)家共同面對(duì)的日益嚴(yán)峻的環(huán)境問(wèn)題。臭氧作為一種主要的氧化型空氣污染物，其對(duì)人體健康的危害引起了

2、普遍關(guān)注，大多數(shù)國(guó)家已對(duì)大氣中O3的濃度閾值作出了限制。 支氣管哮喘是一種以肥大細(xì)胞反應(yīng)、嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)為主的氣道慢性炎癥性疾病，以氣道高反應(yīng)性(AHR)為主要特征，并伴有不同程度的、廣泛的、可逆性氣道通氣障礙的臨床癥狀。其發(fā)病率近幾十年來(lái)在世界范圍呈上升趨勢(shì)，且城市明顯高于農(nóng)村。目前原因未明，鑒于人類基因不可能在近幾十年內(nèi)發(fā)生明顯的變異，單純用遺傳因素難以解釋，也無(wú)法解釋城鄉(xiāng)之間的這種差別。因此環(huán)境因素可能是危險(xiǎn)因素之一，尤其

3、是屬于無(wú)抗原性的氧化性環(huán)境致炎因子在引發(fā)氣道高反應(yīng)性中可能起了重要的作用。 鑒于臭氧是一種具有強(qiáng)氧化性的空氣污染物，國(guó)內(nèi)外針對(duì)臭氧與哮喘發(fā)病的關(guān)系展開了廣泛的實(shí)驗(yàn)研究。研究涉及臭氧的致炎、引發(fā)氣道高反應(yīng)性及肺功能降低、加強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞的功能等毒效應(yīng)，但這些研究大多探討急性臭氧暴露后6——24小時(shí)以后的炎癥反應(yīng)，較少涉及臭氧暴露對(duì)氣道炎癥啟動(dòng)機(jī)制的探討。本研究結(jié)合目前臨床對(duì)支氣管哮喘發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)，聯(lián)系人群實(shí)際臭氧暴露濃度，運(yùn)用大

4、鼠過(guò)敏性哮喘動(dòng)物模型與正常非致敏大鼠進(jìn)行對(duì)比，探討臭氧暴露如何在整體動(dòng)物水平誘導(dǎo)氣道炎癥的啟動(dòng)。 研究目的1.觀察臭氧暴露后早期氣道氧化產(chǎn)物、前炎癥因子的表達(dá)情況及次級(jí)效應(yīng)細(xì)胞——T淋巴細(xì)胞的活化狀態(tài)，探討臭氧暴露是否循激發(fā)變態(tài)反應(yīng)過(guò)程誘導(dǎo)氣道炎癥的啟動(dòng)； 2.根據(jù)臭氧暴露是否在哮喘模型動(dòng)物和非模型動(dòng)物中都能循激發(fā)變態(tài)反應(yīng)過(guò)程誘導(dǎo)氣道炎癥的啟動(dòng)，并結(jié)合氣道炎癥的反應(yīng)類型，探討臭氧作為環(huán)境中的致炎因子在哮喘發(fā)病中對(duì)不同體質(zhì)

5、個(gè)體所起的作用。 研究?jī)?nèi)容與方法1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本研究選用6周齡，體重110±8g的SPF級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，將其隨機(jī)分為12組，具體參考表1。各組動(dòng)物暴露完后立刻行股動(dòng)脈采血和支氣管-肺泡灌洗(BronchoalveolarLavage，BAL)，取樣后測(cè)定各指標(biāo)的水平。 2.指標(biāo)檢測(cè)：2.1測(cè)定哮喘模型大鼠實(shí)驗(yàn)期間的體重日平均增長(zhǎng)量(AverageDailyIncrementofBody-weight，ADIB

6、)、反應(yīng)氣道炎癥類型的支氣管肺泡灌洗夜(BronchoalveolarLavageFluid，BALF)細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，描繪反應(yīng)氣道高反應(yīng)性的呼吸曲線，評(píng)價(jià)大鼠過(guò)敏性哮喘模型的建立情況； 2.2臭氧暴露后對(duì)動(dòng)物的BALF進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)，并結(jié)合肺組織病理切片評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)的臭氧暴露能否誘導(dǎo)氣道炎癥的發(fā)生或促進(jìn)模型動(dòng)物的炎癥； 2.3測(cè)定臭氧暴露后支氣管—肺泡灌洗液(BALF)中丙二醛(Malondialdehyde，

7、MDA)含量變化，分析臭氧暴露與自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化的關(guān)系，評(píng)價(jià)臭氧所致氣道氧化損傷狀況； 2.4測(cè)定臭氧暴露后動(dòng)物BALF中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素—哮喘大鼠肺組織病理切片HE染色可見支氣管粘膜下、血管腔內(nèi)、小氣道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，臭氧暴露進(jìn)一步增加上述細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞的脫落。 3.臭氧暴露與氣道氧化損傷的關(guān)系在暴露時(shí)間一致的情況下，1h暴露中，非模型組0.

8、5mg/m3臭氧暴露與0.16mg/m3臭氧暴露BALF中MDA含量高于過(guò)濾空氣暴露組(P＜0.05)；模型組0.5mg/m3臭氧暴露BALF中MDA含量高于0.16mg/m3臭氧暴露和過(guò)濾空氣暴露(P＜0.05)，0.16mg/m3臭氧暴露BALF中MDA含量高于過(guò)濾空氣暴露(P＜0.05)。8h暴露中，非模型組0.5mg/m3臭氧暴露與0.16mg/m3臭氧暴露BALF中MDA含量高于過(guò)濾空氣暴露(P＜0.05)；模型組0.5mg/

9、m3臭氧暴露BALF中MDA含量高于0.16mg/m3臭氧暴露和過(guò)濾空氣暴露(P＜0.05)，0.16mg/m3臭氧暴露BALF中MDA含量高于過(guò)濾空氣暴露。在暴露濃度一致的情況下，0.5mg/m3臭氧暴露中，非模型組和模型組8h臭氧暴露BALF中MDA含量均高于1h臭氧暴露(P＜0.05)。 4.臭氧暴露對(duì)BALF細(xì)胞因子含量的影響4.1IL-1β含量的變化在暴露時(shí)間一致的情況下，1h暴露中，模型組0.5mg/m3臭氧暴露BA

10、LF中IL-1β含量高于過(guò)濾空氣暴露(P＜0.05)。8h暴露中，非模型組0.5mg/m3臭氧暴露BALF中IL-1β含量高于過(guò)濾空氣暴露和0.16mg/m3臭氧暴露(P＜0.05)；模型組0.5mg/m3臭氧暴露BALF中IL-1β含量高于過(guò)濾空氣暴露(P＜0.05)。在暴露濃度一致的情況下，非模型組和模型組在0.16mg/m3和0.5mg/m3臭氧暴露中都未能觀察到1h暴露和8h暴露BALF中IL-1β含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(P＞0

11、.05)。 4.2IL-6含量的變化在暴露時(shí)間一致的情況下，1h暴露和8h暴露中，非模型組和模型組各臭氧暴露濃度間BALF中IL-6含量比較，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；在暴露濃度一致的情況下，非模型組和模型組在0.16mg/m3和0.5mg/m3臭氧暴露中都未能觀察到1h暴露和8h暴露BALF中IL-6含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(P＞0.05)。 4.3sICAM-1含量的變化在暴露時(shí)間一致的情況下，1h暴露和8h

12、暴露中，非模型組和模型組各臭氧暴露濃度間BALF中sICAM-1含量比較，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；在暴露濃度一致的情況下，非模型組和模型組在0.16mg/m3和0.5mg/m3臭氧暴露中都未能觀察到1h暴露和8h暴露BALF中sICAM-1含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(P＞0.05)。 5.臭氧暴露對(duì)大鼠外周血CD25+T細(xì)胞表達(dá)的影響在暴露時(shí)間一致的情況下，1h暴露中，模型組0.5mg/m3臭氧暴露組和0.16mg/m3

13、臭氧暴露組CD25+T細(xì)胞表達(dá)率均高于過(guò)濾空氣暴露組(P＜0.05)。8h暴露中，非模型組0.5mg/m3臭氧暴露CD25+T細(xì)胞表達(dá)率高于過(guò)濾空氣暴露與0.16mg/m3臭氧暴露(P＜0.05)；模型組0.5mg/m3臭氧暴露與0.16mg/m3臭氧暴露CD25+T細(xì)胞表達(dá)率均高于過(guò)濾空氣暴露(P＜0.05)。在暴露濃度一致的情況下，0.16mg/m3臭氧暴露中，非模型組和模型組中都未能觀察到1h和8h暴露間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(P＞

14、0.05)；0.5mg/m3臭氧暴露中，非模型組8h臭氧暴露CD25+T細(xì)胞表達(dá)率高于1h臭氧暴露(P＜0.05)。 6.臭氧暴露對(duì)大鼠外周血T細(xì)胞中IL-1βmRNA表達(dá)的影響當(dāng)暴露時(shí)間一致時(shí)，僅在模型組8h暴露中觀察到0.5mg/m3的臭氧暴露IL-1βmRNA表達(dá)量要高于0.16mg/m3臭氧暴露和過(guò)濾空氣暴露(P＜0.05)；而當(dāng)暴露濃度一致時(shí)，各濃度臭氧暴露中非模型組和模型組中都沒(méi)有觀察到1h暴露和8小時(shí)暴露統(tǒng)計(jì)學(xué)上的

15、差別(P＞0.05)。 結(jié)論1.0.16mg/m3和0.5mg/m3的臭氧暴露，無(wú)論是1小時(shí)暴露和8小時(shí)暴露，都能在非模型動(dòng)物和模型動(dòng)物中引起氣道氧化損傷。 2.8小時(shí)0.5mg/m3臭氧暴露能夠引起正常動(dòng)物和模型動(dòng)物BALF中前炎癥因子IL-1β以及外周血CD25+T細(xì)胞表達(dá)的升高，IL-1β和CD25+T細(xì)胞參與了臭氧誘導(dǎo)的氣道炎癥啟動(dòng)。 3.臭氧可以作為無(wú)抗原性的致炎因子，循激發(fā)變態(tài)反應(yīng)的過(guò)程誘導(dǎo)模型大鼠和