SOCS3基因多態(tài)性與慢性丙型肝炎合并胰島素抵抗的關(guān)聯(lián)分析及功能研究.pdf

1、研究背景:
　　慢性丙型肝炎容易合并糖代謝異常,其具體的致病機制仍未完全明確。目前研究提示,HCV核心蛋白誘導(dǎo)SOCS3表達增加,后者可能負性調(diào)控胰島素信號通路,致胰島素抵抗。本研究旨在分析SOCS3啟動子區(qū)SNPs與慢性丙型肝炎合并胰島素抵抗的關(guān)聯(lián)分析及功能研究。
　　研究目的:
　　1.探討SOCS3基因SNPs與慢性丙型肝炎患者合并胰島素抵抗的關(guān)聯(lián)性。
　　2.觀察SOCS3啟動子區(qū)SNPs對PBMC中 S

2、OCS3 mRNA和蛋白表達水平的影響。
　　3.分析SOCS3啟動子區(qū)SNPs對啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　研究方法:
　　1.入組290例未抗病毒治療的慢性丙型肝炎患者,根據(jù)HOMA-IR的檢測值,分為胰島素抵抗組103例(HOMA-IR≥2.5)和非胰島素抵抗組187例(HOMA-IR<2.5)。其中228例非肝硬化非糖尿病的慢性丙型肝炎患者進行SOCS3 SNPs(rs4969168, rs4969170, r

3、s12952093)TaqMan探針基因分型檢測,并通過直接測序法對TaqMan分型結(jié)果驗證。單因素和多因素Logistic回歸分析SOCS3 SNPs rs4969168、rs4969170及 rs12952093與慢性丙型肝炎患者發(fā)生胰島素抵抗的關(guān)聯(lián)性,構(gòu)建與慢性丙型肝炎發(fā)生胰島素抵抗相關(guān)的SOCS3SNPs單體型。
　　2.根據(jù)SNP rs4969170 A/G的SNPs分型結(jié)果分為rs4969170 AA基因型組與AG基因

4、型組,將兩組患者年齡、性別、HCV RNA、病毒基因型、肝臟功能指標和疾病進展階段等指標進行匹配。利用SYBR Green實時熒光定量PCR反應(yīng),檢測rs4969170 AA基因型組與AG基因型組PBMC中SOCS3 mRNA的相對表達水平,比較分析rs4969170不同基因型對PBMC中SOCS3mRNA表達的影響。利用蛋白免疫印跡法,觀察rs4969170 AA基因型組與AG基因型組PBMC中SOCS3蛋白的相對表達水平,比較分析

5、rs4969170不同基因型對PBMC中SOCS3蛋白表達的影響。
　　3.選擇rs4969170 AA基因型組DNA樣本,采用PCR方法擴增SOCS3轉(zhuǎn)錄起始點上游-4.8kb至轉(zhuǎn)錄起始位點下游+1kb啟動子片段,結(jié)合定點突變技術(shù)構(gòu)建含rs4969170GG的長啟動子片段。體外構(gòu)建pGL3-basic與SOCS3 rs4969170 A/G啟動子片段的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HepG2,Huh7,293T細胞,培養(yǎng)48小時后,采用雙熒光素

6、酶活性報告基因檢測系統(tǒng)觀察SOCS3 rs4969170 A/G不同等位基因?qū)幼愚D(zhuǎn)錄活性的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.卡方檢驗提示:rs4969170 AA基因型頻率在胰島素抵抗組明顯高于非胰島素抵抗組(89.5％ vs76.1%, OR=2.693,95%CI:1.221-5.939, P=0.012);rs4969170 A等位基因頻率在胰島素抵抗組也明顯高于非胰島素低抗組(94.8%vs88.0%, OR=2.

7、463,95%CI:1.151-5.271, P=0.017)。SOCS3 rs4969168與rs12952903基因多態(tài)性與胰島素抵抗無顯著關(guān)聯(lián)性。為了排除其他因素影響,我們進行了HOMA-IR的相關(guān)性分析,結(jié)果提示:與HOMA-IR輕度相關(guān)的因素包括 BMI(R=0.211, P=0.000),ALP(R=0.182, P=0.002),ALB(R=0.121, P=0.043)和 TG(R=0.157, P=0.010)。排除B

8、MI,ALP,ALB,TG的干擾后,多因素Logistic回歸提示,慢性丙型肝炎發(fā)生胰島素抵抗的獨立危險因素包括rs4969170 AA基因型(OR=3.005,95%CI:1.194-7.560, P=0.019),HCV genotype1(OR=2.524,95%CI:1.099-5.794, P=0.029),而BMI<23.9 kg/m2是慢性丙型肝炎發(fā)生胰島素抵抗的保護性因素(OR=0.514,95%CI:0.265-0.9

9、99, P=0.05)。
　　2.在定義D’>0.7構(gòu)建連鎖不平衡的前提下,Haploview軟件構(gòu)建3種單體型,單體型A-A(rs4969170-rs12952093)、A-C(rs4969170-rs12952093)及G-C(rs4969170-rs12952093),單體型G-C(rs4969170-rs12952093)在慢性丙型肝炎患者非胰島素抵抗組分布頻率較高(Padjusted=0.011)。研究未發(fā)現(xiàn)單體型A-A

10、(rs4969170-rs12952093)和A-C(rs4969170-rs12952093)與慢性丙型肝炎發(fā)生胰島素抵抗的關(guān)聯(lián)性。
　　3.SYBR Green實時熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果提示,在慢性丙型肝炎患者外周血單個核細胞中 rs4969170 AA基因型組SOCS3 mRNA的相對表達水平顯著高于rs4969170 AG基因型組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。蛋白免疫印跡結(jié)果提示,在慢性丙型肝炎患者外周血單個核細胞中,rs4969

11、170 AA基因型組SOCS3蛋白的相對表達水平顯著高于rs4969170 AG基因型組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SOCS3 mRNA與蛋白的相對表達趨勢基本一致。
　　4.成功構(gòu)建pGL3-SOCS3 rs4969170AA,pGL3-SOCS3 rs4969170 GG重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染HepG2,Huh7,293T細胞系。雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)提示:在HepG2,Huh7,293T細胞系中,SNP rs4969

12、170A/G影響熒光素酶報告基因的表達, rs4969170 AA基因型轉(zhuǎn)錄活性顯著高于rs4969170GG基因型,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.SOCS3 rs4969170 AA基因型和A等位基因與慢性丙型肝炎合并胰島素抵抗顯著相關(guān)。多因素Logistic回歸分析提示,rs4969170 AA基因型是慢性丙型肝炎患者發(fā)生胰島素抵抗獨立相關(guān)危險因素之一。此外,HCV genotype1是慢

13、性丙型肝炎患者發(fā)生胰島素抵抗獨立相關(guān)危險因素,BMI<23.9 kg/m2是慢性丙型肝炎發(fā)生胰島素抵抗的保護因素。
　　2.慢性丙型肝炎患者中,SOCS3 rs4969170AA基因型攜帶者外周血單個核細胞中SOCS3 mRNA及蛋白表達水平高于rs4969170 AG基因型攜帶者。
　　3.慢性丙型肝炎患者中,SOCS3 rs4969170 AA基因型或A等位基因可能增強基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性,上調(diào)基因表達,干擾胰島素信號通路