嗜人按蚊microRNAs的表達(dá)譜分析.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是一類(lèi)重要的調(diào)控基因表達(dá)的大小約19-24個(gè)堿基的單鏈小分子非編碼RNA，在進(jìn)化上高度保守，它廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒等多種生物體內(nèi)。研究揭示miRNAs與胚胎的發(fā)育、干細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、以及不同種類(lèi)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，此外miRNAs還可以通過(guò)調(diào)控宿主的基因表達(dá)來(lái)調(diào)控病原的感染。miRNAs經(jīng)RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體(RISC)作用降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因的翻譯從而達(dá)到調(diào)控作用

2、。在線蟲(chóng)、果蠅、小鼠和人等物種已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的miRNAs功能研究中發(fā)現(xiàn)miRNA的表達(dá)水平在不同組織、不同生長(zhǎng)發(fā)育階段存在顯著差異，這一特征和其他參與調(diào)控基因表達(dá)的分子相同，同時(shí)也提示miRNA有可能參與基因表達(dá)的調(diào)控。
　　 迄今為止，蚊子，昆蟲(chóng)中有關(guān)miRNAs的鑒定報(bào)道有限，蚊子和昆蟲(chóng)通常做為傳播許多人類(lèi)病原體的必要載體。2003年，Wang等在岡比亞按蚊中通過(guò)生物信息學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)了與果蠅miRNA序列相近的38種miRNAs

3、。2007年底，Christine Brunel等采用小RNA克隆結(jié)合生物信息學(xué)分析方法鑒定了18種岡比亞按蚊的miRNAs，并分析了岡比亞按蚊在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段miRNA表達(dá)譜的差異。Knock down岡比亞按蚊Dicerl和Agol mRNA后（岡比亞按蚊的miRNA合成受阻），結(jié)果顯示岡比亞按蚊對(duì)瘧原蟲(chóng)的易感性增加了。2008年Mead等采用小RNA克隆和生物信息學(xué)方法在斯氏按蚊中鑒定出27種miRNAs，并揭示miRNA可能有

4、調(diào)節(jié)蚊生長(zhǎng)發(fā)育和疾病傳播過(guò)程的作用。2010年scalsky等分析鑒定了致倦庫(kù)蚊成蚊和白紋伊蚊C7/10細(xì)胞的miRNAs，發(fā)現(xiàn)miRNAs的表達(dá)在感染西尼羅病毒(WNV)后存在差異，提示miRNAs可能有調(diào)控病毒感染的作用。
　　 嗜人按蚊是我國(guó)特有的蚊種，也是中國(guó)瘧疾的重要傳播媒介。但是目前有關(guān)嗜人按蚊miRNAs的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)illumina Hiseq2000高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析方法，首次對(duì)嗜人按蚊m

5、iRNAs的表達(dá)譜進(jìn)行系統(tǒng)性分析，豐富了蚊miRNA并揭示一些新的蚊特異miRNAs。并用Northern blot鑒定了部分miRNAs在嗜人按蚊不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的差異表達(dá)，為進(jìn)一步研究差異表達(dá)的miRNAs在調(diào)控蚊生長(zhǎng)發(fā)育及其與病原體之間的作用機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 1.通過(guò)illumina Hiseq2000高通量小RNA測(cè)序，生物信息學(xué)分析方法，分析嗜人按蚊miRNAs的表達(dá)譜，豐富對(duì)蚊miRN

6、As了解。
　　 2.Northernblot鑒定miRNAs在嗜人按蚊不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究miRNA在蚊子不同生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.illumina Hiseq2000高通量小RNA測(cè)序及生物信息學(xué)分析嗜人按蚊miRNAs表達(dá)譜。
　　 1.1 樣品收集:成蚊為羽化后48h的嗜人按蚊成蚊。收集時(shí)4℃短暫冷凍分雌雄后分別收集。樣本收集后液氮快速冷凍

7、后置于-80℃儲(chǔ)存。
　　 1.2 RNA提取和鑒定:mirVanaTM miRNA Isolation Kit提取各樣本的總RNA，核酸蛋白分析儀檢測(cè)濃度及純度，并用15％聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定所提總RNA的質(zhì)量。
　　 1.3 小RNA測(cè)序:采用illumina Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)的單端50bp測(cè)序模式對(duì)嗜人按蚊的雌雄成蚊進(jìn)行小RNA高通量測(cè)序。
　　 1.4 原始數(shù)據(jù)的處理:原始數(shù)據(jù)需經(jīng)過(guò)引物與ad

8、aptor序列去除，并經(jīng)過(guò)對(duì)測(cè)序片段堿基的質(zhì)量檢驗(yàn)和長(zhǎng)度篩選，最終選擇質(zhì)量可靠的測(cè)序片段。同時(shí)選擇長(zhǎng)度大于15bp，小于32bp的read(clean data)保留下來(lái)用于后續(xù)分析。
　　 1.5 小RNA序列(clean data)的比對(duì)分析:將上述clean data序列與岡比亞按蚊和埃及伊蚊的基因組序列、外顯子、內(nèi)含子比對(duì)，并與miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(miRBasel9.0)中所有miRNA前體(hairpin)、所有物種已知

9、的成熟miRNA比對(duì)，并選取Rfam(10.1)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)注釋測(cè)序得到的小RNA序列，盡可能的發(fā)現(xiàn)并去除其中可能的rRNA，scRNA，snoRNA，snRNA，tRNA1.6 miRNA表達(dá)量計(jì)算:非編碼miRNA表達(dá)量計(jì)算是將與參考基因組序列匹配的clean reads(來(lái)自clean data)采用cufflink軟件，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算每條miRNA表達(dá)量。miRNA表達(dá)量計(jì)算采用FPKM計(jì)算度量指標(biāo)(FPKM-Fragment

10、s Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped),計(jì)算miRNA(hairpin)區(qū)間內(nèi)miRNA表達(dá)量。FPKM含義是:以每百萬(wàn)比配序列每1Kbp長(zhǎng)度做RNA表達(dá)量指標(biāo)，其中轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度和總比配read數(shù)目用于歸一化計(jì)算樣本的表達(dá)量數(shù)值。
　　 1.7 miRNA差異表達(dá)分析:對(duì)兩組之間的表達(dá)譜進(jìn)行差異分析。
　　 1.8 新miRNA預(yù)測(cè):采用miRD

11、eep預(yù)測(cè)方法預(yù)測(cè)識(shí)別新miRNA，并采用RNA-fold預(yù)測(cè)分析miRNA結(jié)構(gòu)。
　　 2.Northern雜交驗(yàn)證嗜人按蚊miRNAs在不同發(fā)育階段的的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.嗜人按蚊雌雄成蚊的小RNA測(cè)序結(jié)果以及生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，共有151種已知的蚊miRNAs在嗜人按蚊雌雄成蚊中表達(dá)，雌雄成蚊的miRNAs表達(dá)有性別差異，如mir-989在雌蚊中高表達(dá)，而在雄蚊中幾乎不表達(dá)。
　　

12、 2.Northern blot鑒定嗜人按蚊miRNAs在不同發(fā)育階段的表達(dá)，結(jié)果提示miRNAs存在期特異性表達(dá)，如miR-2943只在嗜人按蚊卵表達(dá)，而在其幼蟲(chóng)、蛹及成蚊期幾乎不表達(dá)，推測(cè)miRNA-2943可能跟蚊卵的發(fā)育有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.用高通量小RNA測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)分析得到了嗜人按蚊miRNAs的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)部分miRNAs在雌雄成蚊中的表達(dá)量有明顯差異。
　　 2.Northern