優(yōu)質(zhì)棉纖維發(fā)育品質(zhì)相關(guān)基因的分離、克隆、鑒定與定位.pdf

1、棉花是世界重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。棉纖維是棉子上的一種表皮毛，也是重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值之所在，是紡織工業(yè)的原料。優(yōu)良的纖維品質(zhì)是世界棉花育種的主要目標(biāo)之一。因此，從分子水平闡明棉纖維發(fā)育的機(jī)理，具有重要的理論價(jià)值與現(xiàn)實(shí)意義。本研究的目的即利用基因芯片方法篩選與棉纖維品質(zhì)相關(guān)的EST，并分離和鑒定部分棉纖維發(fā)育相關(guān)基因，這些研究將有助于我們進(jìn)一步探討形成優(yōu)質(zhì)纖維的分子機(jī)理。 構(gòu)建高強(qiáng)纖維種質(zhì)系7235開(kāi)花后5-25天棉纖維伸長(zhǎng)、次生壁加厚期

2、間的cDNA文庫(kù)，隨機(jī)大規(guī)模測(cè)序，獲得1436條EST，制成基因芯片。提取7235和纖維品質(zhì)一般的陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1不同發(fā)育時(shí)期的mRNA與之雜交，篩選到31條差異表達(dá)EST，主要是參與代謝、次級(jí)代謝、脅迫與抗逆、轉(zhuǎn)錄等相關(guān)基因。通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證，23條差異表達(dá)EST與基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。 為了進(jìn)一步定位這些差異表達(dá)EST并分析其與纖維品質(zhì)性狀的相關(guān)性，我們分析了所有差異表達(dá)EST在7235與TM-1間的多態(tài)性。結(jié)果

3、表明，三條EST在7235與TM-1間存在多態(tài)。利用(7235×TM-1) RIL群體，對(duì)這三條EST進(jìn)行染色體定位及單標(biāo)記分析，結(jié)果表明，兩條EST(分別編碼LTP基因與ADH基因)與纖維品質(zhì)性狀極顯著相關(guān)。由于大部分基因在7235與TM-1間不存在差異，所以，我們利用[(TM-1×Hai7124)×TM-1]群體對(duì)其進(jìn)行定位。結(jié)果表明，13條差異表達(dá)EST被定位到四倍體棉花遺傳圖譜的相應(yīng)染色體上，其中8條EST定位在品質(zhì)相關(guān)QTL區(qū)

4、間或附近。 通過(guò)基因芯片技術(shù)，我們鑒定了一條可能編碼谷氨酰胺合成酶的EST。Northern雜交驗(yàn)證了該基因在7235與TM-1開(kāi)花后8天的胚珠和纖維中表達(dá)有顯著差異。隨后，利用7235纖維cDNA文庫(kù)測(cè)序，結(jié)合5'RACE技術(shù)從7235纖維中獲得了全長(zhǎng)谷氨酰胺合成酶基因。序列分析結(jié)果表明，該基因與已報(bào)道的其他植物的細(xì)胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶(GS1)基因具有較高氨基酸序列同源性，命名為GhGS。Southern blot分析結(jié)果表明

5、，GhGS在陸地棉基因組的A、D亞基因組可能各存在一個(gè)拷貝。之后，從不同材料7235、TM-1、非洲棉、雷蒙德氏棉基因組中分離到GhGS基因序列。根據(jù)7235與TM-1基因組GhGS-列的SNP，將該基因在(7235×TM-1) RIL群中進(jìn)行定位并分析基因與纖維表型的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GhGS與纖維強(qiáng)度存在相關(guān)，但由于該RIL圖譜上的位點(diǎn)較少，GhGS基因不能整合到該圖譜上。隨后，利用[(TM-1×Hai7124)×TM-1]群體，將

6、GhGS基因定位在四倍體棉花遺傳圖譜的D7染色體上，另外，我們測(cè)定了棉纖維發(fā)育不同時(shí)期胚珠和纖維的GS活力和總蛋白含量。測(cè)定結(jié)果表明，在開(kāi)花后5天和8天的7235胚珠GS活力顯著高于TM-1相應(yīng)時(shí)期的胚珠GS活力。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，開(kāi)花后11天的7235胚珠總蛋白含量和胚珠重量都顯著高于同時(shí)期TM-1胚珠總蛋白含量和重量。這一結(jié)果暗示GS可能通過(guò)提供N而促使棉花種子的形成。而在纖維中的測(cè)定結(jié)果表明，在7235中GS活力和總蛋白含量都低于TM-1

7、中的GS活力和總蛋白含量。這一結(jié)果暗示GS在胚珠和纖維中行使的功能可能并不完全相同。GS在纖維發(fā)育過(guò)程中的可能功能還需進(jìn)一步探討。 另一個(gè)克隆的基因?yàn)橹久富颉Ｍㄟ^(guò)對(duì)7235纖維cDNA文庫(kù)測(cè)序，獲得一個(gè)可能編碼脂肪酶的cDNA片段.隨后，利用RACE技術(shù)獲得該cDNA全長(zhǎng)并命名為GhLipase。序列分析結(jié)果表明，GhLipase全長(zhǎng)1286bp，包含一個(gè)編碼368個(gè)氨基酸的開(kāi)放讀碼框。BLAST分析表明，它與已報(bào)道的其他植

8、物的脂肪酶基因具有較高的氨基酸序列同源性。從表達(dá)特征看，GhLipase在胚珠和纖維細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)，而且在開(kāi)花后5-17天的纖維中表達(dá)水平較高。Southern blot結(jié)果表明，GhLipase基因在陸地棉基因組中可能存在兩個(gè)拷貝。將該基因定位在四倍體棉花遺傳圖譜的A13染色體上。 第三個(gè)利用7235cDNA文庫(kù)分離的基因?yàn)槟揪厶撬饷富?。該cDNA全長(zhǎng)1790bp，ORF編碼560個(gè)氨基酸。CDS分析表明，GhXyl基因推導(dǎo)

9、的氨基酸含有糖基水解酶家族10的保守區(qū)域，具有典型的糖基水解酶家族10基因結(jié)構(gòu)，BLAST結(jié)果表明其與來(lái)源于其他植物的木聚糖水解酶有較高的同源性，命名為GhXyl基因。RT-PCR和Northern blot分析結(jié)果表明，GhXyl屬纖維細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)，且在開(kāi)花后5-8天的纖維中表達(dá)水平最高。Southern雜交結(jié)果表明木聚糖水解酶基因在陸地棉基因組中存在兩個(gè)拷貝。將該基因定位在四倍體棉花遺傳圖譜的A3染色體上。 本研究利用723

10、5纖維cDNA文庫(kù)，還分離到六個(gè)小分子質(zhì)量的熱激蛋白基因，分別命名為L(zhǎng)MWHSP1、LMWHSP2、LMWHSP3、LMPVHSP4、LMWHSP5、LMWHSP6。分析它們的序列結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它們分別屬于三種不同類(lèi)型的小熱激蛋白，LNWHSP1、LMWHSP2、LMWHSP4、LMWHSP6都與細(xì)胞質(zhì)I類(lèi)熱激蛋白序列同源性較高，而LMWHSP3與細(xì)胞質(zhì)II類(lèi)熱激蛋白序列同源性較高，LMWHSP5與線(xiàn)粒體熱激蛋白序列同源性較高。對(duì)這六個(gè)小分

11、子質(zhì)量熱激蛋白基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析，結(jié)果表明，它們?cè)诿藁w內(nèi)具有不同的表達(dá)特征，LMWHSP2是組成型表達(dá)的基因，LMWVHSP1、LMWHSP4、LMWHSP5.LMWHSP6都在開(kāi)花當(dāng)天的胚珠中表達(dá)量最高，而LMWHSP3在棉花葉片中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。這一結(jié)果暗示，線(xiàn)粒體小熱激蛋白和細(xì)胞質(zhì)I類(lèi)小熱激蛋白基因可能受纖維啟始和分化的調(diào)控，而細(xì)胞質(zhì)II類(lèi)小熱激蛋白與棉花葉片的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。利用本實(shí)驗(yàn)室的四倍體棉花遺傳圖譜，對(duì)這六個(gè)小熱激蛋白基因進(jìn)