Cr(Ⅵ)誘導Hep3B細胞線粒體依賴性凋亡與鈣穩(wěn)態(tài)失衡的研究.pdf

1、目的： 通過體外試驗，初步探討六價鉻（hexavalent chromium，Cr（Ⅵ））誘導Hep3B細胞凋亡與鈣穩(wěn)態(tài)失衡之間的關系及相互作用機制。 方法： 以Hep3B肝癌細胞為受試細胞，通過MTT試驗分別檢測Cr（Ⅵ）、線粒體保護劑（DZ）及鈣離子螯合劑（BAPTA/AM）單獨及其與共處理對Hep3B細胞存活率的影響，通過單細胞凝膠電泳實驗觀察細胞DNA損傷情況，篩選出Cr（Ⅵ）染毒濃度及有效的DZ、BAP

2、TA/AM干預濃度。其后續(xù)試驗DZ定為50μmol/L，BAPTA/AM為20μmol/L，預處理1h，Cr（Ⅵ）作用濃度為20μmol/L，染毒時間為6h。將Hep3B細胞隨機分成對照組（第1組）、Cr（Ⅵ）染毒組（第2組）、DZ+Cr（Ⅵ）干預染毒組（第3組）、BAPTA/AM+Cr（Ⅵ）干預染毒組（第4組）、BAPTA/AM+DZ+Cr（Ⅵ）聯(lián)合干預染毒組（第5組）。姬姆薩染色、電鏡觀察及彗星實驗法觀察細胞凋亡形態(tài)及細胞DNA損傷

3、情況，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，熒光分光光度法檢測線粒體通透性轉運孔（PTP）及跨膜電位（△ψm）、熒光比色法檢測細胞內鈣離子濃度，化學比色法檢測線粒體Ca2+-ATP酶。 結果： 1.Cr（Ⅵ）染毒及干預后染毒處理對Hep3B細胞存活率的影響：不同濃度Cr（Ⅵ）單獨處理Hep3B細胞24h，Cr（Ⅵ）染毒各組與對照組相比細胞存活率存在顯著性差異（P<0.05），隨Cr（Ⅵ）濃度的增加，Hep3B細胞存活率有下降的趨勢，

4、且存在著濃度-反應關系（P<0.01），其相關系數(shù)r=-0.948。在50μmol/L濃度的DZ和20μmol/L濃度的BAPTA/AM預處理細胞1h后，20μmol/LCr（Ⅵ）染毒Hep3B細胞的存活率與20μmol/L Cr（Ⅵ）單獨處理細胞存活率相比有明顯增高。 2.染毒與干預處理對Hep3B細胞形態(tài)學的影響：光鏡下姬姆薩染色觀察發(fā)現(xiàn)，20μmol/L Cr（Ⅵ）處理6h，引起部分Hep3B細胞皺縮或腫大，染色質濃染，細

5、胞間隙擴大，胞質間空泡增多，細胞膜和核膜不完整或消失，染色質嗜堿性降低；DZ和BAPTA/AM預處理細胞1h后Cr（Ⅵ）染毒6h，可見大部分細胞生長狀況良好，部分細胞胞質出現(xiàn)空泡，少部分細胞核膜不完整。電鏡下觀察，可發(fā)現(xiàn)Cr（Ⅵ）染毒組細胞出現(xiàn)表面微絨毛減少，線粒體腫脹、嵴消失、空泡狀變，細胞核內出現(xiàn)透亮區(qū)、呈空泡狀變等細胞凋亡或壞死的表現(xiàn)；DZ預處理對線粒體有一定的保護作用。 3.染毒與干預處理對Hep3B細胞DNA損傷的影響

6、：Cr（Ⅵ）染毒組、DZ+Cr（Ⅵ）干預染毒組、BAPTA/AM+Cr（Ⅵ）干預染毒組與DZ+BAPTA/AM+Cr（Ⅵ）聯(lián)合干預染毒組細胞DNA損傷程度與對照組相比顯著增加（P<0.05），而加入線粒體保護劑DZ和細胞內鈣離子螯合劑BAPTA/AM預處理后，各干預染毒組與Cr（Ⅵ）染毒組相比，DNA損傷程度明顯減輕（P<0.05）。 4.染毒與干預處理對Hep3B細胞凋亡的影響：流式細胞儀檢測顯示20μmol/L Cr（Ⅵ）染

7、毒組壞死細胞和凋亡細胞比對照組明顯增多；DZ、BAPTA/AM預處理細胞1h后Cr（Ⅵ）染毒6h，各干預處理組正常細胞比Cr（Ⅵ）染毒組明顯增多，壞死細胞和凋亡細胞，比Cr（Ⅵ）染毒組明顯減少。 5.染毒與干預處理對Hep3B細胞線粒體膜的影響：Cr（Ⅵ）染毒組及各干預染毒組細胞與對照組相比PTP開放度明顯增加（P<0.05），線粒體膜電位明顯降低（p<0.05）；各干預染毒組與Cr（Ⅵ）染毒組相比PTP開放度明顯降低（P<0.

8、05），線粒體膜電位明顯升高（P<0.05）。 6.染毒與干預處理對Hep3B細胞內Ca2+濃度的影響：Cr（Ⅵ）染毒組及各干預染毒組與對照組相比，細胞內Ca2+濃度明顯增加（P<0.05）：各干預染毒組與Cr（Ⅵ）染毒組相比，細胞內Ca2+濃度明顯降低（P<0.05）。 7.染毒與干預處理對Hep3B細胞質膜和線粒體膜Ca2+_ATP酶的影響：Cr（Ⅵ）染毒組、BAPTA/AM+Cr（Ⅵ）干預染毒組細胞膜Ca2+-AT

9、P酶活力比對照組明顯降低（P<0.05）；各干預染毒組細胞膜Ca2+-ATP酶活力與Cr（Ⅵ）染毒組比較明顯增加（P<0.05）。Cr（Ⅵ）染毒組及各干預染毒組線粒體膜Ca2+-ATP酶活力與對照組相比均明顯降低（P<0.05）； DZ+Cr（Ⅵ）干預染毒組、DZ+BAPTA/AM+Cr（Ⅵ）聯(lián)合干預染毒組線粒體膜Ca2+-ATP酶活力與Cr（Ⅵ）染毒組比較明顯增加（P<0.05）。 結論： 20μmol/L Cr（Ⅵ）