HPV16L1-UL138多表位嵌合病毒樣顆粒的制備及免疫效應分析.pdf

1、目的:
　　[1]預測并篩選富含B細胞表位和CTL表位的HCMV UL138片段。
　　[2]構(gòu)建富含B細胞表位及CTL表位片段的畢赤酵母真核表達質(zhì)粒pPIC3.5K/HPV16 L1/UL13815-27和pPIC3.5K/HPV16 L1/UL13896-138。
　　[3]利用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達HPV16 L1/UL13815-27、HPV16 L1/UL138969-138蛋白，并采用肝素親和層析法純化嵌合V

2、LPs并加以鑒定。
　　[4] HPV16 L1-UL138嵌合VLPs免疫BALB/c小鼠，通過ELISA和CTL活性檢測實驗分析其誘導的特異性抗體水平及CTL活性。
　　方法:
　　[1]自NCBI網(wǎng)站獲得HCMV UL138基因全序列，運用生物信息學方法預測UL138的B細胞表位和CTL9肽表位，篩選富含B細胞和CTL表位的UL13896-138及HCMV UL13815-27片段。
　　[2]在不改變氨基

3、酸密碼的前提下，采用酵母偏愛的同義密碼子替代野生型HPV16 L1基因序列中的酵母稀有密碼子，全基因合成。選擇富含CTL表位的UL13815-27及富含B細胞表位的UL13896-138序列，分別設(shè)計互補的核苷酸鏈，退火后即可獲得UL13815-27及UL13896-138序列，并分別與密碼子優(yōu)化的HPV16 L1基因連接，克隆至pPIC3.5K真核表達載體中構(gòu)建pPIC3.5K/HPV16 L1/UL13815-27和pPIC3.5K

4、/HPV16 L1/UL13896-138嵌合重組質(zhì)粒，通過酶切、PCR和測序鑒定。
　　[3]嵌合重組質(zhì)粒經(jīng)BglⅡ酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化至GS115菌株中，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。陽性菌株經(jīng)甲醇誘導后，以HPV16 L1單克隆抗體檢測目的蛋白表達;采用肝素親和層析法純化嵌合VLPs并在透射電鏡下觀察其形態(tài)。
　　[4]用純化的HPV16 L1/UL13815-27、 HPV16 L1/UL13896-138嵌合VLPs免疫BALB

5、/c小鼠，設(shè)置HPV16 L1及PBS作為對照組，每組6只小鼠，間隔2周免疫，共免疫3次。免疫前及每次免疫后1周斷尾取血并分離血清，第3次免疫后1周，眼眶采血，處死小鼠后，分離脾細胞，進行LDH法檢測誘導的CTL反應。小鼠血清HPV16 L1和UL138特異性抗體采用ELISA檢測。
　　結(jié)果:
　　[1]運用生物信息學方法預測出的UL138的HLA-A*0201限制性CTL9肽表位為:UL13815-23(VMLVLIVA

6、I)、UL13816-24(MLVLWAIL)及UL13819-27(LIVAILCYL);優(yōu)勢B細胞表位是:UL13871-87(AVRRESDRRYRFSERPD)、UL13894-108(EEVSSQCSYASSRIT)、UL138104-123(SSRITDRRAGSS SSSSVHVA)、UL138123-138(ANQRNSVPPPDMAVTA)、UL138147-157(KPVTGSATQFT)。
　　[2]優(yōu)化、合

7、成了HPV16 L1基因并將其克隆到了真核表達載體pPIC3.5K上，成功構(gòu)建了pPIC3.5K/HPV16 L1重組質(zhì)粒。獲得上述表位的基因序列合成后將其與優(yōu)化好的HPV16 L1基因連接并克隆到了pPIC3.5K表達載體上，PCR、酶切和測序分析均表明成功構(gòu)建了pPIC3.5K/HPV16 L1重組質(zhì)粒、pPIC3.5K/HPV16 L1/UL13815-27和pPIC3.5K/HPV16 L1/UL13896-138嵌合重組質(zhì)粒。

8、
　　[3]成功構(gòu)建的重組畢赤酵母甲醇誘導后，SDS-PAGE和Western blot證實重組酵母菌裂解產(chǎn)物存在目的蛋白。肝素親和純化后，透射電鏡觀察到了直徑大約55nm的VLPs。
　　[4]小鼠免疫后，ELISA結(jié)果顯示，HPV16 L1-UL138多表位嵌合病毒樣顆粒能誘導小鼠產(chǎn)生高水平的HPV16 L1特異性和HCMV UL138特異性的IgG抗體。
　　結(jié)論:
　　[1]應用免疫信息學方法預測了HCM

9、V UL138優(yōu)勢的B細胞和CTL表位。
　　[2]根據(jù)酵母密碼子偏愛性優(yōu)化了野生型HPV16 L1基因，構(gòu)建了pPIC3.5K/HPV16 L1重組質(zhì)粒、 pPIC3.5K/HPV16 L1/UL13815-27和pPIC3.5K/HPV16 L1/UL13896-138嵌合重組質(zhì)粒。
　　[3]利用整合型重組畢赤酵母表達系統(tǒng)成功表達了HPV16 L1-UL138多表位嵌合病毒樣顆粒，并在透射電鏡下觀察到了直徑大約55nm