生物人工肝聚砜膜中空纖維反應(yīng)器的初步研究.pdf

1、反應(yīng)器是生物人工肝(Bioartificialliver，BAL)系統(tǒng)的核心部分，其性能直接關(guān)系到人工肝支持的效率和效果。由于同種肝細(xì)胞、肝細(xì)胞株和肝干細(xì)胞分別存在來源困難、安全隱患和研究欠深入等問題，故培養(yǎng)異種肝細(xì)胞的中空纖維反應(yīng)器成為BAL研究的主要方向。聚砜膜具有良好的熱穩(wěn)定性、耐氧化性、機(jī)械加工性，但是其對肝細(xì)胞的粘附性及對肝細(xì)胞功能發(fā)揮的影響尚不清楚。生物反應(yīng)器膜材料的性能、適合于BAL的細(xì)胞培養(yǎng)方式、中空纖維反應(yīng)器的性能都是

2、BAL研究中需要解決的問題。 本實(shí)驗(yàn)觀察原代乳豬肝細(xì)胞在聚砜膜界面生長的形態(tài)，檢測聚砜膜生物界面對乳豬肝細(xì)胞的合成功能和生物轉(zhuǎn)化功能的影響，以評價聚砜膜是否為良好的反應(yīng)器膜材料；應(yīng)用磁力攪動法進(jìn)行乳豬肝細(xì)胞多細(xì)胞聚集體的培養(yǎng)，觀察多細(xì)胞聚集體的形態(tài)和功能，探索適合于BAL的細(xì)胞培養(yǎng)方式；采用聚砜膜中空纖維反應(yīng)器構(gòu)建生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，觀察乳豬肝細(xì)胞多細(xì)胞聚集體接種到反應(yīng)器的生長情況和功能變化及該系統(tǒng)對重型肝炎病人血漿(Sever

3、ehepatitisplasma，SHP)的影響，以評價聚砜膜中空纖維反應(yīng)器的性能。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下： 一、乳豬肝細(xì)胞在聚砜膜生物界面生長的研究 觀察乳豬肝細(xì)胞在聚砜膜生物界面的生長情況，檢測其白蛋白合成、尿素合成、氯化銨清除、酶漏出量的情況，并與乳豬肝細(xì)胞在聚苯乙烯界面生長的情況進(jìn)行對比分析。形態(tài)觀察顯示，在聚砜膜界面生長的乳豬肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，大小均一，呈球型粘附、鋪展，形成多細(xì)胞聚集體。在培養(yǎng)過程中，聚砜膜上生長的

4、肝細(xì)胞白蛋白合成率、尿素合成率和氨清除率均優(yōu)于聚苯乙烯界面生長的乳豬肝細(xì)胞，聚砜膜和聚苯乙烯兩組的乳豬肝細(xì)胞LDH和AST漏出量在低水平波動，兩組肝細(xì)胞的LDH、AST含量無顯著性差異。 二、磁力攪動法培養(yǎng)乳豬肝細(xì)胞多細(xì)胞聚集體的觀察 將新分離的乳豬肝細(xì)胞懸液放入平底燒瓶中，利用磁力攪拌器和攪拌子，進(jìn)行多細(xì)胞聚集體的磁力攪動培養(yǎng)，計算多細(xì)胞聚集體的形成率、貼壁率，觀察多細(xì)胞聚集體的形態(tài)，檢測多細(xì)胞聚集體的白蛋白合成量、尿

5、素合成量、酶漏出量等指標(biāo)。在培養(yǎng)過程中，多細(xì)胞聚集體形成率隨時間的延長而上升，貼壁率隨時間的延長而下降，6h，多細(xì)胞聚集體的形成率為73.5±10.5％，貼壁率在78.6±6.9％。多細(xì)胞聚集體多為10～20個乳豬肝細(xì)胞組成，直徑在100～200μm之間，形態(tài)規(guī)則，輪廓清晰，超微結(jié)構(gòu)基本正常。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，多細(xì)胞聚集體能保持較好的白蛋白合成率、尿素合成率。本實(shí)驗(yàn)中多細(xì)胞聚集體培養(yǎng)液上清的AST和LDH漏出量的水平較高，尤其以前2h為

6、最。 三、聚砜膜中空纖維反應(yīng)器性能的評價 利用聚砜膜中空纖維反應(yīng)器和Cello培養(yǎng)循環(huán)式人工毛細(xì)管培養(yǎng)裝置構(gòu)建反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，將磁力攪動法培養(yǎng)所得的多細(xì)胞聚集體接種到反應(yīng)器外腔，觀察反應(yīng)器中培養(yǎng)的多細(xì)胞聚集體的白蛋白合成量、尿素合成量、酶漏出量及對SHP的影響。在整個實(shí)驗(yàn)時間里，反應(yīng)器外腔所留標(biāo)本測得肝細(xì)胞的白蛋白合成率隨時間的延長而升高，而反應(yīng)器內(nèi)腔所留標(biāo)本未測出豬白蛋白。尿素合成率隨時間的延長而升高，AST濃度先升后

7、降，LDH濃度則持續(xù)上升，在48～72h期間顯著增高。在整個實(shí)驗(yàn)時間里，SHP的氨濃度持續(xù)降低，2h較之0h有顯著性差異，其后血氨濃度下降趨勢減緩；總膽紅素濃度持續(xù)降低，6h的總膽紅素濃度接近0h的2/3；凝血酶原時間持續(xù)降低，總降低量達(dá)5s左右；TNF-α、TGF-β1含量持續(xù)降低，0～2h內(nèi)變化最大，2h較之0h有顯著性差異，其后下降趨勢減緩。 以上結(jié)果提示：1、聚砜膜具有較好的生物相容性，乳豬肝細(xì)胞能以多細(xì)胞聚集體的形式在

8、其表面生長，同聚苯乙烯界面相比，其分泌、合成、轉(zhuǎn)化、解毒功能均顯著提高，肝細(xì)胞膜無明顯損傷。聚砜膜可以作為良好的BAL反應(yīng)器膜材料。2、磁力攪動多細(xì)胞聚集體培養(yǎng)法，能在6h內(nèi)培養(yǎng)形成數(shù)量較多、形態(tài)結(jié)構(gòu)較好、大小合適的多細(xì)胞聚集體，其超微結(jié)構(gòu)基本正常，能保持較好的肝細(xì)胞功能，但仍有部分肝細(xì)胞的細(xì)胞膜受損。磁力攪動法可望成為較好的BAL細(xì)胞培養(yǎng)方式。3、聚砜膜中空纖維反應(yīng)器能為肝細(xì)胞提供良好的生長代謝環(huán)境，乳豬肝細(xì)胞的多細(xì)胞聚集體在聚砜膜中