酒精性肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肝組織TLR和促-抗炎細胞因子的基因表達及抗菌藥物干預(yù).pdf

1、目的：探討酒精性肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肝組織TLR和促/抗炎細胞因子的基因表達以及抗菌藥物頭孢哌酮鈉聯(lián)用乳酸左旋氧氟沙星對其的干預(yù)效應(yīng)。 方法： 1、清潔級雄性SD大鼠100只，根據(jù)隨機數(shù)字表將大鼠分為兩組，即酒精性肝病組(90只)和正常對照組(10只)。酒精性肝病組大鼠按參考文獻[1]用56％的酒精(5g/kg體重)每24小時灌胃1次，正常對照組以等容積的生理鹽水灌胃，共10周。隨機取正常對照組(N組)存活大鼠6只。取

2、酒精性肝病組存活大鼠60只，根據(jù)隨機數(shù)字表將大鼠分為10組，每組6只。1組為酒精性肝病組(A組)。4組大鼠下肢皮下注射創(chuàng)傷弧菌懸液，為酒精性肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥組(AV組)，于染菌后2h、6h、12h、24h處死。4組在注射創(chuàng)傷弧菌后4h起，予腹腔注射(ip)頭孢哌酮鈉和乳酸左旋氧氟沙星，每日2次，為酒精性肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥抗菌藥物治療組(AVA組)，分別在注射創(chuàng)傷弧菌后6h、12h、24h、10d處死。余1組酒精性肝病大鼠注射等量抗菌藥

3、物，為酒精性肝病抗菌藥物對照組(AA組)。各時相點動物數(shù)均為6只。無菌取部分肝組織于液氮中保存待用。 2、第10周末隨機選取酒精性肝病組大鼠2只，麻醉后處死，取肝組織送檢病理。取酒精性肝病組及正常對照組大鼠下腔靜脈血，檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)。 3、觀察AV組和AVA組大鼠在染菌及藥物干預(yù)后的體溫、呼吸、精神狀態(tài)等情況的改變。 4、采用Trizol試劑提取各組大鼠肝組織總RNA，紫

4、外分光光度計測定RNA濃度，以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后以cDNA為模板，以大鼠TLR2、TLR4、MD-2、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10引物進行PCR擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)成像，QuantityOne分析軟件進行分析，以(目的基因/β-actin)為該基因表達的相對值。 5、實驗資料采用均數(shù)±標(biāo)準差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS12.0進行t檢驗、方差分析等處理。

5、p＜0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果： 1、大鼠肝臟病理及肝功能檢查酒精性肝病組大鼠肝組織可見脂肪肝，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不一的脂滴空泡，竇內(nèi)皮細胞腫脹、增生，匯管區(qū)有炎細胞浸潤。酒精性肝病組大鼠血清AST、ALT水平較正常對照組明顯升高，差異有顯著性(P＜0.01)。 2、AV組染菌后6h，大鼠開始出現(xiàn)較明顯的毒血癥狀，表現(xiàn)為呼吸加快，皮溫升高，下肢腫脹。隨著時間的延長，膿毒癥癥狀表現(xiàn)得越明顯。到24h大鼠表現(xiàn)為紫

6、紺、間斷抽搐等；AVA組在藥物干預(yù)后上述癥狀逐漸減輕，大鼠均存活。 3、N組、A組、AA組大鼠肝組織TLR2mRNA表達量較低。AV組染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝組織TLR2mRNA表達量均明顯高于N組與A組(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后12h為最高。AVA組染菌后6h、12h肝組織TLR2mRNA表達量仍明顯高于N組及AA組(P＜0.05)，后逐漸降低。與相同時間點的AV組相比，染菌后6h、12h、24h

7、時的AVA組TLR2mRNA表達量均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。 4、N組、A組、AA組大鼠肝組織TLR4mRNA表達量較低。AV組染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝組織TLR4mRNA表達量均明顯高于N組與A組(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后12h為最高。AVA組染菌后6h、12h肝組織TLR4mRNA表達量明顯高于N組(P＜0.05或P＜0.01)，染菌后6hTLR4mRNA表達量明顯高于AA組(P

8、＜0.05)，后逐漸降低。與相應(yīng)時間點的AV組相比，染菌后6h、12h、24h時的AVA組TLR4mRNA表達量均明顯降低(P＜0.01)。 5、N組、A組、AA組大鼠肝組織MD-2mRNA表達量較低。AV組染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝組織MD-2mRNA表達量均明顯高于N組與A組(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后12h為最高。AVA組染菌后6h、12h肝組織MD-2mRNA表達量仍明顯高于N組與AA組(P＜0

9、.01)，后逐漸降低。與相同時間點的AV組相比，染菌后6h、12h、24h時的AVA組MD-2mRNA表達量均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。 6、N組、A組、AA組大鼠肝組織TNF-αmRNA表達量較低。AV組染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝組織TNF-αmRNA表達量均明顯高于N組與A組(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后24h為最高。AVA組染菌后6h、12h肝組織TNF-αmRNA表達量仍明顯高于N組

10、與AA組(P＜0.01)，后逐漸降低。與相應(yīng)時間點的AV組相比，染菌后12h、24h時的AVA組TNF-αmRNA表達量均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。 7、N組、A組、AA組大鼠肝組織IL-1βmRNA表達量較低。AV組染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝組織IL-1βmRNA表達量均明顯高于N組與A組(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后24h為最高。AVA組染菌后6h、12h、24h肝組織IL-1βmRNA

11、表達量仍明顯高于N組與AA組(P＜0.05或P＜0.01)，后逐漸降低。與相同時間點的AV組相比，染菌后12h、24h時的AVA組IL-1βmRNA表達量均明顯降低(P＜0.01)。 8、N組、A組、AA組大鼠肝組織IL-6mRNA表達量較低。AV組染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝組織IL-6mRNA表達量均明顯高于N組(P＜0.05或P＜0.01)，染菌后6h、12h、24h的大鼠肝組織IL-6mRNA表達量均明顯高于

12、A組(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后24h為最高。AVA組染菌后6h、12h肝組織IL-6mRNA表達量仍明顯高于N組及AA組(P＜0.05或P＜0.01)，后逐漸降低。與相應(yīng)時間點的AV組相比，染菌后24h時的AVA組IL-6mRNA表達量明顯降低(P＜0.01)。 9、N組、A組、AA組大鼠肝組織IL-10mRNA表達量較低。AV組染菌后12h、24h的大鼠肝組織IL-10mRNA表達量均明顯高于N組與A組(p＜0.

13、05)，以染菌后24h為最高。AVA組染菌后6h、12h、24h肝組織IL-10mRNA表達量仍明顯高于N組及AA組(p＜0.05或p＜0.01)，后逐漸降低。與相應(yīng)時間點的AV組相比，染菌后24h時的AVA組IL-10mRNA表達量明顯降低(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.酒精性肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肝組織TLR2、TLR4、MD-2mRNA表達量在膿毒癥早期即明顯升高，后期有所下降。酒精性肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥早期大鼠肝組

14、織TNF-α、IL-1βmRNA表達量明顯升高，膿毒癥早中期肝組織IL-6mRNA表達量增多，膿毒癥中后期肝組織IL-10mRNA表達量逐漸增多。 2.及早使用頭孢哌酮鈉和乳酸左旋氧氟沙星可明顯減低酒精性肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肝組織TLR2、TLR4、MD-2、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10mRNA表達水平，有利于機體致炎/抗炎平衡恢復(fù)。 3.組織Toll樣受體及其配體表達上調(diào)可能通過Toll樣受體介導(dǎo)的炎