哲羅鮭胰島素樣生長因子Ⅱ原核表達、多克隆抗體的制備及組織表達分析.pdf

1、在魚類胚胎發(fā)育過程中，胰島素樣生長因子-II（insulin-like growth factors-II，IGF-II）起著關鍵的作用。哲羅鮭（Hucho taimen）是鮭科魚類中最大的個體，其細嫩的肉質(zhì)、鮮美的味道具有很高的食用與經(jīng)濟價值，目前國內(nèi)還沒有關于哲羅鮭的IGF-II基因的研究。本研究根據(jù)GenBank里收錄的鮭鱒魚IGF-II基因序列設計引物P1、P2，以哲羅鮭肝臟RNA提取物為模板，利用RT-PCR方法擴增出哲羅鮭I

2、GF-II基因開放閱讀框。首先本研究利用生物學軟件對成功克隆出的哲羅鮭IGF-II基因開放閱讀框進行了生物信息學分析，其中利用MegAlign軟件中默認的Clustal W模式對IGF-II核苷酸序列與氨基酸序列進行同源性分析。利用DNAMAN翻譯獲得IGF-II氨基酸序列，利用Protean軟件進行IGF-II蛋白分子量及等電點進行了預測，采用Clustalx1.83軟件和MEGA5.0軟件構(gòu)建了IGF-II核酸序列系統(tǒng)進化樹。其次，

3、本研究根據(jù)哲羅魚IGF-II基因開放閱讀框序列，利用Primer軟件設計了一對用于做熒光實時定量PCR的引物IGF-II-F、IGF-II-R，利用熒光實時定量PCR方法來檢測二齡哲羅鮭IGF-II基因在不同組織中的表達情況。最后本研究將目的基因IGF-II與原核表達載pSUMO連接構(gòu)建出重組表達載體pSUMO-IGF-II。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta中利用IPTG進行目的蛋白的誘導表達。對包涵體形式存在的原核表達蛋白進行

4、變性/復性后獲得較純的目的蛋白，利用ELISA和MTT方法對目的蛋白進行免疫學活性及生物學活性分析。然后利用有生物活性和免疫活性的目的蛋白免疫小鼠，獲得鼠抗血清。利用ELISA方法檢測獲得的哲羅鮭IGF-II抗體的效價；本研究旨在為哲羅魚的生長模式和生長繁殖的研究奠定基礎。相應的實驗結(jié)果如下：
　　1.克隆的哲羅鮭IGF-II基因的生物信息學與組織表達分析
　　克隆出的哲羅鮭的IGF-II基因開放閱讀框序列經(jīng)過測序后，用bl

5、ast和DNAMAN比對分析結(jié)果正確后，利用生物信息學軟件對目的片段進行分析，結(jié)果顯示哲羅鮭IGF-II基因的長度為645bp，編碼的蛋白質(zhì)含有214個氨基酸殘基，該蛋白質(zhì)的相對分子量為24.554kDa，等電點為9.92；哲羅鮭IGF-II前肽由信號肽、B、C、A、D、E六部分構(gòu)成；同源性比對和系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，哲羅鮭IGF-II與鮭科魚類IGF-II同源性最高，其中與大西洋鮭的IGF-II同源性最高（98％），該基因在進化的過程

6、中有著高度保守的進化特性；熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示，該基因在肝臟中的表達量最高，在心、鰓、脾、后腸、頭腎、胃中次之，而在前腸和腦中的表達量最低。
　　2.哲羅鮭IGF-II基因的原核表達、活性鑒定與抗體制備
　　將測序結(jié)果正確的目的片段與原核表達載pSUMO連接，經(jīng)PCR和Bsa I和BamH I雙酶切驗證成功構(gòu)建出重組表達載體pSUMO-IGF-II，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達菌株Rosetta中后，經(jīng)IPTG誘導，產(chǎn)生了N端

7、帶有SUMO標簽的重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示，約在40kD處含有清晰的條帶，與預期結(jié)果相符。并且檢測結(jié)果顯示目的蛋白是以包涵體形式存在的。然后利用8M的尿素進行蛋白變性，2M的尿素復性，經(jīng)過透析純化后獲得高濃度的目的蛋白。利用ELISA對目的蛋白進行免疫學活性分析。ELISA結(jié)果顯示該目的蛋白能夠與商品化的抗鮭鱒魚IGF-II的抗體發(fā)生特異性反應，并且呈現(xiàn)抗原濃度依賴性，該結(jié)果說明本研究獲得了具有良好免疫原性的IGF-II

8、蛋白；在利用MTT方法測定IGF-II蛋白對鯉（Cyprinus carpio）上皮細胞（Epitheliaoma Papulosum Cyprini，EPC）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）性腺細胞（Rainbow trout gonad，RTG-2）的增殖效果來鑒定IGF-II蛋白的生物學活性，結(jié)果顯示所表達的哲羅鮭IGF-II蛋白能夠有效的刺激EPC細胞和RTG-2細胞增殖。該結(jié)果表明利用原核表達系統(tǒng)獲得的哲羅魚I