亞洲落葉松八齒小蠹伴生真菌致病性及特異性檢測(cè).pdf

1、落葉松屬植物（Larix spp.）在我國(guó)分布廣泛，是我國(guó)速生豐產(chǎn)用材林的重要樹(shù)種。亞洲落葉松八齒小蠹(Ips subelongatus Motschulsky)是一種危害落葉松的蛀干害蟲(chóng)，主要分布于我國(guó)東北和華北地區(qū)。作為我國(guó)林業(yè)危險(xiǎn)性有害生物，危害枯立木和健康樹(shù)種，對(duì)落葉松林造成了巨大的損失。小蠹蟲(chóng)與真菌能夠形成穩(wěn)定的伴生關(guān)系，伴生真菌對(duì)于削弱寄主樹(shù)木抗性、協(xié)助小蠹蟲(chóng)侵害樹(shù)木、維護(hù)小蠹蟲(chóng)種群密度等方面起著重要的作用，其中許多伴生真菌

2、是具有強(qiáng)致病力的重要植物病原物?；谏鲜稣撌?，開(kāi)展本項(xiàng)研究，以期為有效控制落葉松八齒小蠹的危害提供理論依據(jù)。
　　本研究在前期研究的基礎(chǔ)上選擇了落葉松八齒小蠹伴生真菌區(qū)系中的優(yōu)勢(shì)種(Ophiostoma kryptum,Endoconidiophora fujiensis,O.cf.bicolor,O.brunneociliatum)，人工接種于華北落葉松（L.prineipis-rupprechtii）成年（40年生）植株上，模

3、擬小蠹蟲(chóng)侵入寄主的方式，采用高密度接種方法和低密度接種方法進(jìn)行致病性的測(cè)定。結(jié)合前人研究結(jié)果和致病性研究結(jié)果，根據(jù)Harrington等人的方法將來(lái)自華北落葉松、長(zhǎng)白落葉松和興安落葉松的E.fujiensis和O.kryptum的菌株人工接種于分布在不同地區(qū)的三種落葉松及日本落葉松上進(jìn)行致病力差異測(cè)定。根據(jù)致病性結(jié)果對(duì)強(qiáng)致病力真菌進(jìn)行快速特異性的檢測(cè)。同時(shí)對(duì)分布在不同地區(qū)的長(zhǎng)白落葉松，興安落葉松和華北落葉松三種森林生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)生的八齒小

4、蠹的蟲(chóng)體和坑道組織進(jìn)行伴生真菌的分離純化，進(jìn)行生理學(xué)特性、菌落特征、微觀形態(tài)學(xué)的觀察，以及多位點(diǎn)DNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，明確了落葉松八齒小蠹伴生真菌區(qū)系中Graphium屬和Leptographium屬真菌組成。
　　對(duì)伴生菌優(yōu)勢(shì)種致病性測(cè)定結(jié)果表明，O.kryptum的致病力最強(qiáng)，E.fujiensis次之，O.cf.bicolor和O.brunneociliatum致病力較弱。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)寄主為興安落葉松的E.fujie

5、nsis菌株在華北落葉松上的致病性，明顯弱于寄主為華北落葉松的菌株在其上的致病性，證明不同寄主的E.fujiensis菌株致病力可能存在差異。并且在中國(guó)落葉松上分離的O.kryptum菌株致病力與前人研究中寄主為歐洲落葉松的O.kryptum菌株致病力結(jié)果不同，說(shuō)明其可能存在致病力差異。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)E.fujiensis和O.kryptum致病力差異測(cè)定，研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同寄主的O.kryptum菌株對(duì)4種落葉松致病力差異不大，而來(lái)自分布

6、在不同地區(qū)的3種落葉松寄主的E.fujiensis菌株致病力存在差異，其中來(lái)自華北落葉松的菌株致病力最強(qiáng)，來(lái)自長(zhǎng)白落葉松的菌株次之，來(lái)自興安落葉松的菌株最差。表明菌株在致病性上具有致病性分化特征，結(jié)合前期的多基因序列研究，E.fujiensis可能存在著寄主長(zhǎng)期脅迫下的種下分化現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自中國(guó)3種落葉松的E.fujiensis的所有菌株對(duì)日本落葉松的致病力大于對(duì)中國(guó)本地落葉松的致病力，對(duì)日本落葉松表現(xiàn)為強(qiáng)致病菌，與日本國(guó)內(nèi)的

7、測(cè)定結(jié)果相一致，而O.kryptum菌株對(duì)中國(guó)本地落葉松和日本落葉松致病力相同，說(shuō)明E.fujiensis對(duì)日本落葉松具有強(qiáng)致病力。相比日本落葉松的感病性，我國(guó)本地落葉松與病原的協(xié)調(diào)進(jìn)化過(guò)程中演化出了穩(wěn)定的抗病性。
　　通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定和基于ITS2-LSU、β-tubulin和TEF-1α基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，分離到Leptographium屬真菌3種，其中2種為新種，分別定名為L(zhǎng)eptographiumzhangense Li

8、u,Lu&Zhang sp.nov.和Leptographium innermongoliaae Liu,Lu&Zhangsp.nov.，另外1種是L.taigense，系首次在中國(guó)發(fā)現(xiàn)。L.zhangense，屬于Leptographiumpiceiperda種復(fù)合體，在系統(tǒng)發(fā)育分析中與L.piceaperda和L.aenigmatica具有較近的親緣關(guān)系，而在形態(tài)上與L.laricis相似，二者相比子囊頸長(zhǎng)寬度和子囊孢子的形狀大小存

9、在差異。L.innermongoliaae與L.taigense親緣關(guān)系較近，二者形態(tài)上都具有synnematous無(wú)性型。兩個(gè)新種分別從菌落特征、生長(zhǎng)速率、分生孢子等方面與現(xiàn)有Leptographium屬種形態(tài)近似種區(qū)分。3種Leptographium屬真菌均在寄主為興安落葉松的韌皮部分離得到，為亞洲落葉松八齒小蠹與長(zhǎng)喙殼類(lèi)真菌的新伴生關(guān)系。
　　通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，共分離到Graphium屬真菌2種:G.larici

10、s和G.carbonarium，其中G.laricis為中國(guó)新紀(jì)錄種。G.laricis和G.carbonarium都屬于G.penicillioides種復(fù)合體，二者都是首次從亞洲落葉松八齒小蠹上分離到，與落葉松八齒小蠹形成新的小蠹蟲(chóng)-真菌伴生關(guān)系，并且增加了兩種真菌的寄主種類(lèi)，擴(kuò)大了其分布范圍和寄主的種類(lèi)。
　　基于對(duì)落葉松八齒小蠹伴生菌區(qū)系和致病性的研究，選擇強(qiáng)致病力優(yōu)勢(shì)種O.kryptum和E.fujiensis對(duì)其進(jìn)行快

11、速特異性PCR檢測(cè)，分別篩選出特異性引物對(duì)OK1/OK2和CFU1/CFU2。引物對(duì)OK1/OK2對(duì)于O.kryptum菌株均表現(xiàn)有1條248bp的清晰明亮條帶，而其他菌種則無(wú)該條帶。引物對(duì)CFU1/CFU2對(duì)于E.fujiensis菌株均表現(xiàn)有1條251bp的清晰明亮條帶，而其他菌種則無(wú)該條帶。使用特異性引物能夠直接從木塊標(biāo)本的混合DNA中檢測(cè)出O.kryptum和E.fujiensis，縮小了工作時(shí)間，提高工作效率并且還能檢測(cè)費(fèi)用低