Notch受體與EB病毒感染及平滑肌細(xì)胞的基因調(diào)控.pdf

1、Notch是一個(gè)跨膜受體。Notch受體通過(guò)與膜上配體的相互作用而被激活，在哺乳類其配體特指Jagged/Delta。Notch受體至少含有三個(gè)位點(diǎn)(S1-S3)，在此位點(diǎn)蛋白水解酶使跨膜受體裂解。在成熟期間，300 kDa的蛋白前體在s1位點(diǎn)被Furine樣的轉(zhuǎn)化酶所裂解。Notch受體一配體的相互作用誘導(dǎo)進(jìn)一步分離，首先在S2位點(diǎn)排除Notch受體細(xì)胞外部分(Notch extracellular domain，NEC)，然后在S3

2、位點(diǎn)釋放Notch受體細(xì)胞內(nèi)部分 (Notch intracellular domain，Notch-IC)。分離以后，Notch-IC就轉(zhuǎn)移進(jìn)入核內(nèi)，與RBP.J(在哺乳動(dòng)物中又稱CBFl)相互作用并調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在哺乳動(dòng)物中已有4個(gè)Notch基因(Notch1，Notch2，Notch3和Notch4)被描述，它們編碼只有單一跨膜區(qū)的受體。幾個(gè)哺乳類動(dòng)物的靶基因通過(guò)Notch-IC和RBP-J/CBF1的相互作用而被誘導(dǎo)，像HES

3、 or Hes(the hairy enhancer of split)和HRT or Hey(hairy-related transcription factor,Hairy相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子)。 EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)通過(guò)引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞潛伏感染，在人類建立了終生持續(xù)型感染狀態(tài)，并可以導(dǎo)致淋巴細(xì)胞性及上皮性惡性腫瘤。近來(lái)研究顯示，EBV感染的B淋巴細(xì)胞永生化依賴于病毒攜帶的一個(gè)B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化基本調(diào)節(jié)

4、因子EBNA2(EB病毒核心抗原2)。盡管在基因序列上沒(méi)有相關(guān)性，Notch受體和EBNA2卻共同具有一些生化和功能上的特性，例如都相互作用于NOtch信號(hào)通路上的核心因子，RBP-J kappa (又稱CBF1)。然而，在調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路基因表達(dá)方面，Notch與EBNA2相互關(guān)系還不清楚。本研究選擇Notch2受體和EBNA2基因?yàn)槟繕?biāo)，應(yīng)用HeLa細(xì)胞和Cos7細(xì)胞與不同的載體瞬間聯(lián)合轉(zhuǎn)染，實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄-PCR(QRTPCR)，

5、CBF1和HES1啟動(dòng)子熒光素酶分析及Notch2-RNAi干擾技術(shù)，探討Notch2-IC與EBNA2相互作用關(guān)系。 在現(xiàn)有的研究中，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)度表達(dá)的Notch2-IC或EBNA2載體可以明顯上調(diào)CBF1啟動(dòng)子表達(dá)，CBF1啟動(dòng)子突變后(3XMT)，N2IC則完全喪失對(duì)CBF1啟動(dòng)子的上調(diào)作用，而EBNA2則部分喪失對(duì)CBF1啟動(dòng)子的上調(diào)作用，說(shuō)明由Notch-IC和EBNA2調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子系列有重疊但不等同。同時(shí)研究結(jié)果顯示

6、，N2IC和EBNA2均能有效地激活HES1啟動(dòng)子活性表達(dá)，說(shuō)明Notch與EBNA2可以共同作用于Notch基因家族的下游信號(hào)通路。令人感興趣的是，Notch2-RNAi(干擾Notch2使無(wú)其活性)可以削弱EBNA2介導(dǎo)的CBF1和HES1表達(dá)。 我們的結(jié)果證實(shí)，在EBNA2介導(dǎo)的信號(hào)通路中，活化的Notch2起關(guān)鍵性作用，提示Notch信號(hào)(尤其內(nèi)源性Notch)可能參與：EBV感染過(guò)程中EBNA2調(diào)節(jié)。 Notc

7、h受體家族在決定細(xì)胞的最終命運(yùn)及血管形成方面起重要作用。Notch受體與配體混合物存在的多樣性表明每個(gè)Notch受體可能具有不同的作用。在這里，我們報(bào)道了Notch-1與Notch-2在血管平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)過(guò)程中新的作用機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法包括：用不同血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cell，VSMC)與不同的載體瞬間聯(lián)合轉(zhuǎn)染，實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄- PCR(QRTPCR)，[<'3>H]脫氧胸腺嘧啶核苷接

8、合實(shí)驗(yàn)，蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)，人p27<'KIP1>啟動(dòng)子熒光素酶分析，染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)及 HES1-RNAi干擾技術(shù)。同時(shí)構(gòu)建了A7r5(胚胎期大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞)穩(wěn)定表達(dá)Notchl-IC和Notch2-IC細(xì)胞株及人p27<'KIP1>啟動(dòng)子熒光素酶-HES1結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變載體。 我們觀察到，Notch-1細(xì)胞內(nèi)與激活相關(guān)的關(guān)鍵區(qū)(N1-IC)高表達(dá)可通過(guò)提高細(xì)胞周期抑制劑p27<'

9、KIP1>的表達(dá)，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)。相反，Notch-2細(xì)胞內(nèi)與激活相關(guān)的關(guān)鍵區(qū)(N2-IC)則表現(xiàn)為刺激血管平滑肌生長(zhǎng)及誘導(dǎo)p27<'KIP1>表達(dá)水平降低。p27<'KIP1>啟動(dòng)子5'端大約3.5kb的啟動(dòng)子區(qū)域基因刪除圖譜分析結(jié)果表明：存在于-774與-549bp之間區(qū)域的cis-物質(zhì)對(duì)N1-IC與N2-IC參與的p27<'KIP1>轉(zhuǎn)錄激活的不同的調(diào)節(jié)作用起關(guān)鍵作用，并且此區(qū)域包含有假定的HES1聯(lián)結(jié)區(qū)，實(shí)際上N1-

10、IC對(duì)HES1的表達(dá)起上調(diào)作用，N2-IC則無(wú)此作用。而且，HES1在N1-IC與N2-IC參與的p27<'KIP1>基因轉(zhuǎn)錄的不同反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用。此作用已經(jīng)通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證，包括直接定位點(diǎn)突變和染色質(zhì)免疫沉淀及RNAi對(duì)HES1的基因干擾作用。更進(jìn)一步，干擾HES1基因會(huì)引起N1-IC誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制作用與N2-IC刺激的平滑肌生長(zhǎng)作用得到潛在性的削弱。以上結(jié)果表明：Notch—1與Notch-2受體分別調(diào)控眾多與No