高選擇性識(shí)別半胱氨酸的雙光子熒光探針及其在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用.pdf

1、繼生物光學(xué)顯微鏡、普適性生物熒光顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡之后，雙光子熒光顯微鏡已經(jīng)成為新一代的細(xì)胞和組織的微觀成像工具。與傳統(tǒng)的單光子熒光共聚焦顯微鏡相比，雙光子熒光顯微鏡在成像細(xì)胞和組織方面顯示出了許多顯著的優(yōu)勢(shì):紅外激發(fā)、生物樣品穿透深度大、自發(fā)熒光低、生物樣品的光損傷小、明顯延長(zhǎng)活細(xì)胞和組織的觀測(cè)時(shí)間等。特別地，雙光子熒光顯微鏡在對(duì)活性生物樣品的觀測(cè)上體現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，這使得生物科學(xué)家們得以在活的細(xì)胞和組織中觀察和研究生命過(guò)程。

2、熒光顯微探測(cè)技術(shù)與熒光探針是相互依存互相促進(jìn)的，新的熒光技術(shù)需要新的探針，新的探針將使探測(cè)技術(shù)更加完善。雙光子熒光探針的研究是隨著雙光子熒光顯微鏡的出現(xiàn)而逐漸發(fā)展起來(lái)的，但其研究工作的相對(duì)滯后則限制了它們?cè)陔p光子熒光顯微鏡上的廣泛應(yīng)用。因此，發(fā)展具有大活性吸收截面的、高熒光量子產(chǎn)率的雙光子熒光探針具有非常重要的科學(xué)價(jià)值和研究意義。目前已有很多種特定用途的雙光子熒光探針報(bào)道。這些探針主要有雙光子核酸探針、雙光子離子探針、雙光子pH探針、雙

3、光子脂質(zhì)筏探針以及雙光子半胱氮酸/高半胱氨酸探針等。
　　 半胱氨酸(Cysteine，Cys)和高半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)在細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。Cys和Hcy同時(shí)表達(dá)在真核細(xì)胞內(nèi)，其分子結(jié)構(gòu)上只有一個(gè)亞甲基的差別，但功能重要卻完全不同:Cys是構(gòu)成蛋白質(zhì)和谷胱甘肽的氨基酸;Hcy與人類(lèi)的心血管疾病、進(jìn)行性老年癡呆癥有直接關(guān)聯(lián)。針對(duì)目前高選擇性識(shí)別并成像細(xì)胞內(nèi)Cys及Hcy的熒光探針尚不成熟、識(shí)

4、別并成像細(xì)胞內(nèi)Hcy的熒光探針尚無(wú)報(bào)道、高選擇性識(shí)別并利用雙光子熒光顯微鏡成像細(xì)胞內(nèi)Cys的雙光子熒光探針剛剛起步的狀態(tài)，開(kāi)展具有活細(xì)胞通透性的高選擇性識(shí)別Cys或Hcy的雙光子熒光探針的研究是非常重要的。本文成功設(shè)計(jì)并合成了能夠高選擇性識(shí)別Cys的雙光子熒光探針并利用雙光子熒光顯微鏡實(shí)現(xiàn)了其在活細(xì)胞中的熒光成像。
　　 本文利用Vilsmeier反應(yīng)和Heck反應(yīng)等有機(jī)化學(xué)反應(yīng)，以三苯胺和咔唑?yàn)槟阁w，我們成功地制備了一系列能夠

5、選擇性識(shí)別Cys的雙光子生物熒光探針，并通過(guò)核磁共振譜，元素分析，紅外及質(zhì)譜等手段對(duì)目標(biāo)探針?lè)肿舆M(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。這類(lèi)探針?lè)肿拥暮铣陕肪€簡(jiǎn)單，易于操作。這些探針?lè)肿臃謩e用AM1、CA1、CA2、CA3、ZA1和ZA2來(lái)表示。其中，CA2和CA3與CA1表現(xiàn)出了相似的性質(zhì)，本論文著重討論AM1、CA1、ZA1和ZA2的合成和性質(zhì)。
　　 在大量實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn):AM1與CA1是對(duì)檢測(cè)Cys具有高選擇性的雙光子熒光探針，分別發(fā)射紅光與綠

6、光，并且它們能夠在活細(xì)胞中對(duì)Cys進(jìn)行雙光子熒光顯微成像。AM1與CA1本身不具有雙光子熒光性能，與Cys結(jié)合后，AM1+Cys在920nm激發(fā)下的雙光子吸收截面則高達(dá)1700GM(1GM=10-50cm4sphoton-1)，而CA1+Cys在810nm激發(fā)下的雙光子吸收截面為90GM，其作用環(huán)境分別是乙腈-Tris/HCl(v/v，4∶1，tris:10mM，KCl:100mM，pH=7.27)混合溶液和甲醇-Tris/HCl(v/

7、v，4∶1，Tris:10mM，KCl:100mM，pH=7.00)混合溶液。特別地，在雙光子800nm激發(fā)下，AM1+Cys的雙光子熒光強(qiáng)度分別是AM1+NAC(N-乙?；腚装彼?，AM1+Hcy和AM1的11倍、67倍和60倍，而CA1+Cys的雙光子熒光強(qiáng)度分別是CA1+NAC，CA1+Hcy和CA1的2.64倍、77倍和59倍。為了進(jìn)一步考察AM1和CA1與Cys之間的相互作用，我們對(duì)AM1和CA1與Cys進(jìn)行了紫外吸收、單光

8、子熒光、雙光子熒光光譜滴定實(shí)驗(yàn)。其結(jié)果表明，當(dāng)Cys與AM1或CA1之間的摩爾比小于30時(shí)，探針的光物理性質(zhì)沒(méi)有明顯的改變，當(dāng)摩爾比在30-60之間時(shí)，吸光度，單、雙光子熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)，當(dāng)摩爾比大于60時(shí)，這些光物理性質(zhì)均保持穩(wěn)定;AM1和CA1對(duì)Cys的檢測(cè)極限大約在293-408μM。同時(shí)關(guān)于探針AM1和CA1的選擇性我們還做了詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)只有在加入Cys的情況下，探針的吸光度與單、雙光子熒光強(qiáng)度發(fā)生顯著的變化，并伴隨明顯

9、的溶液顏色變化。因此，AM1和CA1既是對(duì)Cys具有高選擇性識(shí)別性能的光開(kāi)關(guān)型(turn-on)雙光子熒光探針，又可以作為檢測(cè)Cys的裸眼探針。我們還研究了生理范圍內(nèi)pH值的變化對(duì)AM1和CA1熒光強(qiáng)度的影響:在pH=4-7.5范圍內(nèi)，pH值的變化對(duì)AM1和CA1熒光性能的影響很小且可以忽略，進(jìn)而認(rèn)為它們?cè)谏锛?xì)胞中的應(yīng)用不會(huì)受到生理環(huán)境中pH變化的影響。另外，我們還對(duì)AM1和CA1與Cys作用的機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)的探討。
　　 與

10、AM1和CA1相比，ZA1和ZA2是能夠?qū)Ｒ蛔R(shí)別Cys的單光子熒光探針。ZA1和ZA2本身沒(méi)有熒光，當(dāng)它們與Cys結(jié)合后發(fā)射較強(qiáng)的藍(lán)色熒光，其熒光強(qiáng)度分別增強(qiáng)105倍和200倍，而當(dāng)加入其它生物分析物后，探針的紫外吸收光譜和熒光光譜并沒(méi)有明顯改變。另外，我們還實(shí)現(xiàn)了ZA1和ZA2在活細(xì)胞中對(duì)Cys的寬場(chǎng)成像。
　　 綜上，本文成功地設(shè)計(jì)并合成了一系列具有高選擇性的Cys熒光探針，并且發(fā)射了紅、綠、藍(lán)三種顏色的熒光。特別地，AM1