選擇性識(shí)別生物重要分子的熒光探針的合成及其生物活性.pdf

1、生物體內(nèi)有眾多活性分子，生物小分子有各種氨基酸以及陰陽(yáng)離子等，面生物大分子有核酸、蛋白質(zhì)等，這些生物分子在生物體內(nèi)都扮演著非常重要的角色。
　　生物小分子，例如半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)以及還原型谷胱甘肽(GSH)等。體內(nèi)半胱氨酸含量的下降將會(huì)導(dǎo)致頭發(fā)褪色、組織浮腫、肝臟損傷、皮膚損害以及生長(zhǎng)過慢等諸多病癥;同型半胱氨酸為體內(nèi)甲硫氨酸代謝的中間產(chǎn)物，其含量升高可能會(huì)引起心血管疾病、骨質(zhì)疏松和阿爾茨海默氏病;而還原型

2、谷胱甘肽對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡狀態(tài)起著非常重要的作用。萘酰亞胺類衍生物具有良好的光學(xué)及化學(xué)穩(wěn)定性、較大的斯托克斯位移以及較高的熒光量子產(chǎn)率。因此，這類物質(zhì)被廣泛用于工業(yè)熒光染色、激光材料、光電轉(zhuǎn)換材料、熒光標(biāo)記以及熒光探針等方面。萘酰亞胺類熒光探針種類繁多，其中4-位取代化合物容易制備和修飾，人們對(duì)其研究最為廣泛，例如4-氨基-1，8-萘酰亞胺。事實(shí)上，3-氨基取代或者3，6-二氨基取代的1，8-萘酰亞胺同樣具有很強(qiáng)的熒光，但是這類

3、探針的報(bào)道相對(duì)較少。
　　生物大分子，例如核酸、蛋白質(zhì)等。核酸作為遺傳物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)、功能以及化學(xué)修飾等均與基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等生命過程密切相關(guān)。而G-四鏈體是特殊的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，它在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡以及腫瘤的形成和發(fā)展中起著重要的作用。人端粒DNA是染色體末端由DNA重復(fù)序列TTAGGG組成的雙螺旋區(qū)，其末端是含有100-200 nt（核苷酸）的富G堿基的單鏈懸突，這些富G的單鏈懸突在一定條件下可形成G-

4、四鏈體。近些年來大部分關(guān)于G-四鏈體的研究都集中在單倍體G-四鏈體，而實(shí)際上端粒末端懸突由100-200 nt的長(zhǎng)鏈端粒DNA序列組成，雖然它們大多數(shù)形成單倍體G-四鏈體，但是仍有少數(shù)可以形成更復(fù)雜的由TTA堿基序列連接的雙倍體或多倍體G-四鏈體結(jié)構(gòu)。研究表明一些疾病如ALS病、脆性X綜合征等與多倍體G-四鏈體有關(guān)，因此選擇性識(shí)別雙倍體或多倍體G-四鏈體有助于更好地理解G-四鏈體的結(jié)構(gòu)和功能，為開發(fā)出以G-四鏈體為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物提供有

5、效指導(dǎo)。
　　熒光探針具有選擇性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單以及能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，它們能夠?qū)崟r(shí)觀測(cè)生物分子在體內(nèi)的含量、分布以及代謝，所以用其來研究生物分子在體內(nèi)所發(fā)揮的作用具有非常重要價(jià)值。因此開發(fā)出高選擇性高靈敏度的熒光探針來檢測(cè)這些生物分子具有重要的意義。
　　目的：
　　本論文開展了生物小分子硫醇和生物大分子-雙倍體G-四鏈體熒光探針的研究，具體如下:
　　方法：
　　以3，6-二氨基-1，8-萘酰亞

6、胺為熒光團(tuán)母體，以2，4-二硝基苯磺?；鶠榉磻?yīng)識(shí)別基團(tuán)，基于磺酰胺鍵斷裂設(shè)計(jì)并合成了選擇性識(shí)別含巰基氨基酸的探針化合物1，并用低分辨質(zhì)譜、高分辨質(zhì)譜、1H NMR和13C NMR進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。生物活性研究表明:化合物1能選擇性識(shí)別含巰基氨基酸，而且有很好的抗干擾能力;相對(duì)于GSH和Hcy，化合物1對(duì)Cys顯示出最高的熒光檢測(cè)靈敏度，其檢測(cè)限達(dá)到2.0×10-7 M;化合物1與Cys、GSH和Hcy的假一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)分別為3.0×10

7、-2 min-1，9.5×10-3 min-1和5.9×10-3 min-1，表明化合物1對(duì)小分子生物硫醇Cys具有更高的識(shí)別速率;質(zhì)譜及核磁共振實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了探針1的反應(yīng)機(jī)理為磺酰胺鍵斷裂的反應(yīng)機(jī)理，與硫醇發(fā)生親核取代反應(yīng)后，ICT機(jī)制受阻，熒光恢復(fù);探針1成功用于檢測(cè)人肝癌細(xì)胞(HepG2)中的含巰基氨基酸。綜上所述，化合物1是一個(gè)優(yōu)良的小分子生物硫醇探針。設(shè)計(jì)并合成了二乙二醇連接的雙小檗堿衍生物2，并用低分辨質(zhì)譜、1HNMR和13C

8、NMR進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。
　　結(jié)果:
　　化合物2能對(duì)G-四鏈體產(chǎn)生熒光響應(yīng)，而且對(duì)雙倍體G-四鏈體(G2T1)的熒光響應(yīng)明顯強(qiáng)于單倍體G-四鏈體(G1)，對(duì)反平行G-四鏈體的熒光響應(yīng)優(yōu)于混合型G-四鏈體;化合物2對(duì)反平行G2T1、反平行G1、混合型G2T1和混合型G1的最低檢測(cè)限分別為7.8×10-10 M、9.6×10-9 M、2.16×10-9 M和1.23×10-8 M，表明化合物2對(duì)雙倍體G-四鏈體的檢測(cè)靈敏度高于單

9、倍體G-四鏈體，并且對(duì)反平行雙倍體G-四鏈體的檢測(cè)靈敏度高于混合型雙倍體G-四鏈體;紫外滴定實(shí)驗(yàn)得到化合物2與反平行G2T1、反平行G1、混合型G2T1和混合型G1的表觀結(jié)合常數(shù)，分別為9.59×106M-1、4.99×105M-1、6.10×108M-1和1.47×106M-1，說明化合物2與雙倍體G-四鏈體的結(jié)合能力強(qiáng)于單倍體G-四鏈體，并且與混合型雙倍體G-四鏈體的結(jié)合能力強(qiáng)于反平行雙倍體G-四鏈體。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)