人AIFC-末端截短體的促細(xì)胞凋亡活性及其分子機(jī)制研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的一類疾病,常規(guī)的治療手段尚不能取得理想的效果,腫瘤基因治療作為一項(xiàng)新興的研究領(lǐng)域,為人類攻克這疾病帶來(lái)了新的希望和契機(jī)。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而殺滅腫瘤的思路,將會(huì)產(chǎn)生一些高效、低毒的腫瘤基因治療方案。凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis inducing factor,AIF)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種線粒體相關(guān)的凋亡效應(yīng)分子,其在線粒體外空間的分布,尤其是在細(xì)胞核內(nèi)的積聚,將足以引起細(xì)胞核染色體凝集和斷裂,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)

2、生,不受Bcl-2過(guò)表達(dá)的影響,抑制caspase的活性仍不能阻止其誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生,而且AIF在低等真核細(xì)胞凋亡以及哺乳類胚胎發(fā)育過(guò)程中具有不可或缺的作用。與caspase等其他凋亡效應(yīng)分子相比,AIF具有不受胞漿中其他凋亡抑制因子抑制,可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的優(yōu)勢(shì)。將其用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,可能具有重要意義。
　　本文利用PCR方法構(gòu)建了AIF截短體AIFΔ1-120、AIFΔ1-480和ΔAIF360-480,為檢測(cè)方便,在截

3、短體分子的C-末端融合了8個(gè)氨基酸殘基組成的FLAG標(biāo)簽,經(jīng)過(guò)酶切鑒定以及DNA測(cè)序證明,各載體構(gòu)建成功;瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,Western Blot證實(shí)截短型AIFΔ1-120、AIFΔ1-480ΔAIF360-480均在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中獲得過(guò)表達(dá),利用激光共聚焦顯微鏡觀察異源性表達(dá)的AIF截短體分子細(xì)胞內(nèi)定位情況,發(fā)現(xiàn)去掉線粒體定位序列(MLS)但保留核定位序列(NLS)的AIFΔ1-120表達(dá)后分布在胞質(zhì)和胞核中,而同時(shí)失去MLS和N

4、LS的AIF截短體(AIFΔ1-480和ΔAIF360-480)僅僅分布在細(xì)胞質(zhì)中;瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,經(jīng)過(guò)Annexin V、TUNEL染色、MTT、集落形成試驗(yàn)等方法證實(shí)AIFΔ1-480能夠和AIFΔ1-120一樣引起細(xì)胞發(fā)生凋亡。AIF的C末端截短體分子可以引起細(xì)胞色素c從線粒體釋放至胞漿,而細(xì)胞色素c結(jié)合Apaf-1可以募集caspase-9形成凋亡體,基于這種機(jī)制,構(gòu)建了caspase-9特異性的siRNA真核表達(dá)載體,經(jīng)

5、DNA序列測(cè)定載體構(gòu)建正確,轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞并用G418篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,用RT-PCR方法檢測(cè)caspase-9 mRNA水平的變化,Western Blot以及間接免疫熒光檢測(cè)caspase-9蛋白水平的改變,證實(shí)成功抑制了caspase-9的表達(dá),將各AIF截短體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染caspase-9表達(dá)被siRNA抑制的HeLa細(xì)胞,經(jīng)過(guò)MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,結(jié)果表明：caspase-9表達(dá)沉寂后AIFΔ1-480的促凋亡活性受到

6、抑制而AIFΔ1-120的促凋亡活性沒(méi)有受到明顯影響。在immunoAIFΔ1-120的基礎(chǔ)上構(gòu)建了新的免疫促凋亡分子,包含有識(shí)別HER-2抗原的單鏈抗體scFv23、綠膿桿菌外毒素轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域PE40和AIFC末端的融合分子,該融合蛋白呈現(xiàn)分泌表達(dá),特異性識(shí)別殺傷HER-2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞,而對(duì)不表達(dá)HER-2抗原的細(xì)胞不具有殺傷作用。與immunoΔAIF120分子相比,新構(gòu)建的免疫促凋亡分子分子量更小,殺傷效率可能更高,因而可能更具有應(yīng)