采用RNAi抑制CDC25A對(duì)照射中CNE-2細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、筆者采用RNAi技術(shù)對(duì)目的基因CDC25A進(jìn)行研究，RNAi是新近發(fā)展的一種封閉基因表達(dá)的有效方法，獲得2006年諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)。它由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默，通過(guò)將雙鏈RNA(dsRNlA)導(dǎo)入細(xì)胞后，在Dicer酶的作用下產(chǎn)生有活性的小干擾RNA(siRNA)，與該段RNA同源的mRNA產(chǎn)生特異性降解，從而導(dǎo)致特異基因表達(dá)抑制的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，具有特異性強(qiáng)、抑制效率高，可擴(kuò)散性、可遺傳性等特點(diǎn)。由于RNAi技術(shù)具有獨(dú)特的作用機(jī)制

2、和簡(jiǎn)便的技術(shù)流程，因此逐步替代反義核酸技術(shù)及基因敲除技術(shù)在基因功能研究上的地位。作為腫瘤基因治療研究的新方法，RNAi技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用和迅速的發(fā)展，但在鼻咽癌的放療和加速再增殖機(jī)理研究領(lǐng)域中，目前尚無(wú)該技術(shù)的報(bào)道。 【研究目的】 采用RNAi技術(shù)沉默鼻咽癌細(xì)胞株(CNE-2)CDC25A基因，了解沉默CDC25A基因后鼻咽癌細(xì)胞株(CNE-2)在照射中的生長(zhǎng)增殖變化情況，初步探討CDC25A表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株(CNE

3、-2)照射的影響，以進(jìn)一步了解鼻咽癌細(xì)胞株(CNE-2)照射中加速再增殖發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制，從而為鼻咽癌非常規(guī)分割放射治療提供理論依據(jù)。 【研究方法】 1.采用RNAi技術(shù)構(gòu)建抑制CDC25A表達(dá)的細(xì)胞株：通過(guò)構(gòu)建siRNA表達(dá)載體，將構(gòu)建的Psilence4.1-CDC25A載體以陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染入CNE-2中，經(jīng)過(guò)G418毒性實(shí)驗(yàn)篩選、陽(yáng)性克隆有限稀釋法篩選等方法，培養(yǎng)出能抑制CDC25A表達(dá)的CNE-2細(xì)胞。

4、 2.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及蛋白印跡法(western blot)在mRNA水平和蛋白水平上驗(yàn)證所篩選出細(xì)胞株的干擾效果，并檢測(cè)在照射下細(xì)胞株CDC25A的表達(dá)變化。 3.四甲基偶氮唑鹽比色法(MTr)及流式細(xì)胞術(shù)(FAM)檢測(cè)在60Co-γ,線，2Gy/d，連續(xù)5天的照射下細(xì)胞株的生長(zhǎng)增殖變化情況及細(xì)胞周期各時(shí)相的分布。 【研究結(jié)論】 1.成功培育出抑制CDC25A表達(dá)的CNE-2細(xì)胞株，命

5、名為Psilence4.1-CDC25A細(xì)胞，對(duì)照株命名為psilence4.1-Control細(xì)胞。 2.抑制CDC25A表達(dá)后的Psilence4.1-CDC25A細(xì)胞無(wú)論是在未照射條件下還是在照射條件下，CDC25A的表達(dá)都下調(diào)，說(shuō)明對(duì)CDC25A干擾的有效性。 3.Psilence4.1-CDC25A細(xì)胞在照射下的生長(zhǎng)增殖趨勢(shì)發(fā)生了改變，生長(zhǎng)增殖趨勢(shì)變緩，生長(zhǎng)增殖高峰延遲，說(shuō)明抑制CDC25A表達(dá)后，鼻咽癌照射加