魚精蛋白PRM基因遺傳變異及其對種公牛精液品質(zhì)的影響.pdf

1、種公牛在奶牛群的遺傳改良中起著關(guān)鍵性的作用，其精液品質(zhì)高低不僅是決定種公牛站經(jīng)濟效益的關(guān)鍵因素，更是影響奶牛受胎率的重要因素。公牛精液品質(zhì)性狀受遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)和飼養(yǎng)管理等多種因素的影響。僅依靠營養(yǎng)、飼養(yǎng)管理及常規(guī)育種的手段，來提高公牛的精液品質(zhì)性狀難度很大，且目標(biāo)周期長、效率低。公牛的精液品質(zhì)性狀屬于數(shù)量性狀，受多基因調(diào)控，且精子發(fā)生過程復(fù)雜，篩選和精液品質(zhì)性狀相關(guān)的主效基因或關(guān)鍵調(diào)控位點對于提高公牛的精液品質(zhì)性狀顯得極為重要。

2、>　　魚精蛋白在精細(xì)胞中是主要的核蛋白，與雄性生殖緊密相關(guān)，對精子的發(fā)育以及正常功能形成產(chǎn)生了重要的影響。鑒于此，本研究選擇魚精蛋白PRM基因(PRM1和PRM2)為候選基因，從基因轉(zhuǎn)錄形成的可變剪切體、基因的啟動子活性、功能性SNPs鑒定及其相關(guān)性分析等方面來研究這些遺傳變異對種公牛精液品質(zhì)性狀的影響，并嘗試分析影響公牛精液品質(zhì)性狀的分子調(diào)控機理。主要研究結(jié)果分述如下：
　　1.中國荷斯坦公牛PRM2基因多態(tài)性研究
　　中

3、國荷斯坦公牛PRM2基因的多態(tài)性的篩查是基于DNA直接測序和軟件比對技術(shù)進行的，在外顯子2處檢測到一個錯義突變的新SNP g.+478 A>G，在編碼氨基酸時將精氨酸（R）錯義為甘氨酸（G）。本實驗通過PCR-RFLP技術(shù)對g.+478 A>G位點進行基因分型，并將各個基因型與公牛精液品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，g.478 A>G位點突變純合基因型GG的個體的采精量、鮮精活力、凍后活力和鮮精密度顯著高于野生純合型AA和雜合型AG(P

4、＜0.05)，畸形率也顯著低于二者(P＜0.05)。因此，GG型個體的精液品質(zhì)較好，GG可作為有利的分子標(biāo)記用于高繁殖力公牛的輔助選育。
　　2.中國荷斯坦公牛PRM2基因可變剪接體研究
　　為了研究PRM2基因可變剪切體在不同組織中的表達模式以及在大小公牛睪丸組織中的差異性表達。本實驗采用RT-PCR技術(shù)檢測了PRM2基因總mRNA在不同組織中的表達，并采用qRT-PCR方法檢測PRM2基因兩個轉(zhuǎn)錄本即全轉(zhuǎn)錄本PRM2-C

5、T和可變剪切本PRM2-TV1在大小牛睪丸組織中的相對表達量。RT-PCR結(jié)果顯示，PRM2-CT和PRM2-TV1在大牛和小牛中均只在睪丸組織中有表達，在心臟組織、肝臟組織、脾臟組織、肺組織和腎臟組織中均不表達。qRT-PCR結(jié)果表明PRM2-CT和PRM2-TV1在成年公牛睪丸中的表達量比小牛睪丸中的表達量高，且在大小公牛睪丸組織中均顯示PRM2-TV1的表達量顯著高于PRM2-CT表達量(P<0.05)。此外，該試驗也說明PRM2

6、-TV1是轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中的主轉(zhuǎn)錄本。
　　3.中國荷斯坦公牛PRM1基因啟動子和功能性SNP的鑒定
　　本試驗通過生物信息學(xué)預(yù)測到PRM1基因存在一個啟動子區(qū)，且通過基因擴增發(fā)現(xiàn)在該啟動子區(qū)存在g.-138.A>G和g.-111.G>A2個SNPs，這兩SNPs位點呈現(xiàn)完全連鎖，因此可將其看作為一個整體SNP-1（g.-138.A>G）進行遺傳研究。此外，還發(fā)現(xiàn)g.-138.A> G位點的突變可以使NF-Zc和H4TF-2轉(zhuǎn)

7、錄因子結(jié)合位點消失，而以往的研究發(fā)現(xiàn)NF-Zc和H4TF-2結(jié)合因子具有促進基因轉(zhuǎn)錄的功能。通過PRM1基因啟動子區(qū)缺失片段的克隆，構(gòu)建出連接不同片段的含熒光素酶報告載體的質(zhì)粒，然后將這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進MLTC-1細(xì)胞中，根據(jù)測定的雙熒光素酶的活性來鑒定PRM1啟動子的核心區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRM1啟動子的核心區(qū)域存在于g.-230~g.-89片段之間，且上述兩個SNPs恰好均位于該核心啟動子區(qū)內(nèi)，同時也驗證了SNPs g.-138.A>G

8、和g.-111.G>A降低了這個核心啟動子區(qū)的活性。RFLP-PCR對SNP g.-138.A>G進行分型并對其與精液品質(zhì)關(guān)聯(lián)性進行分析研究，發(fā)現(xiàn)g.-138.A>G和g.-111.G>A位點中野生純合子的鮮精活力、凍精活力和鮮精密度高于突變純合子和雜合子，畸形率顯著比突變純合子和雜合子低(P<0.05)；這些顯著關(guān)聯(lián)表明 g.-138.A> G-A等位基因和g.-111.G>A-G等位基因可以提高鮮精子的活力。因此，這兩個SNPs可看

9、作選育中國荷斯坦公牛優(yōu)質(zhì)精液品質(zhì)性狀的潛在功能性分子標(biāo)記。
　　4.中國荷斯坦公牛PRM1基因可變剪接體研究
　　采用RT-PCR和基因測序方法鑒定PRM1基因是否存在可變剪切體，如有，就對各轉(zhuǎn)錄本在不同組織中的表達進行檢測；進而采用qRT-PCR方法，檢測在成年公牛和小公牛睪丸中不同剪切體的表達量。通過對基因測序結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)了一個新轉(zhuǎn)錄本（PRM1-TV1），該轉(zhuǎn)錄本缺少包含部分5’UTR和外顯子的片段共78 bp；RT-

10、PCR結(jié)果顯示：PRM1 mRNA在公牛組織中表達具備組織特異性。在成年公牛組織中，PRM1-CT在各組織中均表達且表達量較高，而PRM1-TV1僅在心臟和睪丸組織中表達且表達量較少；在小牛中，PRM1-CT在各組織中僅有微量的表達，但PRM1-TV1在各組織中幾乎不表達。qRT-PCR結(jié)果顯示：PRM1-CT和PRM1-TV1在兩個群體中表達量差異顯著，兩個轉(zhuǎn)錄本在成年公牛睪丸中的表達量比在小牛睪丸中高，并且PRM1-CT的表達量顯著