缺氧人視網(wǎng)膜色素上皮細胞株ARPE-19差異MicroRNA表達及鑒定.pdf

1、第一部分:缺氧人視網(wǎng)膜色素上皮細胞株ARPE-19表達特性
　　 目的:觀察缺氧對人視網(wǎng)膜色素上皮株ARPE-19的細胞形態(tài)、增殖以及對其分泌的血管內(nèi)皮生長因子和色素上皮衍生因子表達的影響。
　　 方法:將ARPE-19細胞分別置正常和缺氧環(huán)境中培養(yǎng)0hr、8hr、24hr、48hr后，MTT比色法檢測ARPE-19細胞的增殖；Hochest染色觀察細胞形態(tài)、檢測細胞凋亡率；流式細胞儀檢測細胞凋亡率；選取缺氧24hr的細

2、胞，RT-PCR檢測VEGF mRNA及PEDF mRNA的表達，經(jīng)計算機圖像處理，定量分析。
　　 結(jié)果:缺氧組的MTT實驗吸光度(A值)明顯低于正常組，缺氧48小時時差異最顯著(P<0.001)；Hochest染色及流式細胞儀檢測細胞凋亡率，缺氧24小時時其凋亡率明顯高于正常組(P<0.001)；RT-PCR檢測VEGF mRNA表達缺氧組明顯高于正常組，PEDF mRNA表達缺氧組明顯低于正常組。
　　 結(jié)論:缺氧

3、可加劇ARPE-19細胞的凋亡，破壞VEGF與PEDF表達的平衡，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜色素上皮細胞的活性是抑制脈絡(luò)膜新生血管生成的關(guān)鍵。
　　 第二部分:缺氧人視網(wǎng)膜色素上皮細胞株ARPE-19 MicroRNA的差異表達
　　 目的: MicroRNA在調(diào)控基因表達及組織功能等方面發(fā)揮著重要的作用。但對其在眼科領(lǐng)域?qū)τ贑NV的形成的調(diào)控卻研究的很少。本部分目的在于篩選CNV形成相關(guān)的MicroRNA。
　　 方法:視網(wǎng)膜

4、色素上皮細胞株ARPE-19置缺氧環(huán)境24小時后，抽提RNA進行MicroRNA芯片(LC science公司)檢測。對于信號值高于1000的差異MicroRNA利用實時定量PCR(q-PCR)進行檢測。
　　 結(jié)果:具有顯著性差異(即p值<0.01)表達轉(zhuǎn)錄子共有42條miRNA，其中低氧后上調(diào)的18條，下調(diào)的24條，信號值差異位居前十位的MicroRNA分別為Mir-1、Mir-1469、Mir-663、Mir-1915、M

5、ir-29c、Mir-574-5p、Mir-638、Mir-29b-1、Mir-1308、Mir-10a，其中除Mir-1、Mir-29c、Mir-1308表現(xiàn)為下調(diào)外，其余均表現(xiàn)為上調(diào)。信號值高于1000的MicroRNA共有28條，其中Mir-638、Mir-1308、Mir-125b、Mir-155、Mir-30c、Mir-125a-5p與芯片檢測結(jié)果相一致，Mir-155表達異常最為顯著。
　　 結(jié)論:視網(wǎng)膜色素上皮細胞

6、株ARPE-19細胞經(jīng)缺氧處理后，很多MicroRNA發(fā)生差異性表達，可能與CNV的形成密切相關(guān)。
　　 第三部分: MicroRNA-155轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜色素上皮細胞株ARPE-19活性初步研究
　　 目的：探討對于視網(wǎng)膜色素上皮細胞株ARPE-19細胞，Mir-155是否具有一定的抗缺氧活性，并對CNV的形成具有一定的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：Mir-155轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮細胞株ARPE-19細胞后，將其置缺氧

7、環(huán)境0hr，8hr、24hr、48hr后，MTT比色法檢測ARPE-19細胞的增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染組的MTT實驗吸光度(A值)高于未轉(zhuǎn)染組，缺氧48小時時差異最明顯；流式細胞儀檢測細胞凋亡率，轉(zhuǎn)染組凋亡率低于未轉(zhuǎn)染組(P<0.001)，缺氧48小時時差異最明顯。
　　 結(jié)論：Mir-155轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮細胞株ARPE-19細胞后，具有一定的抗缺氧活性，對CNV的形成具有一定的調(diào)節(jié)作用。<