普通針毛蕨DEDC誘導腫瘤細胞凋亡信號傳導機制研究.pdf

1、普通針毛蕨Macrothelypteris torresiana (Gaud.)Ching是金星蕨科針毛蕨屬植物,主要分布于我國長江以南各省區(qū)。由于該植物具有親熱解毒，軟堅散結(jié)的功效，在民間常被用于止血和治療水腫。已有文獻報道，普通針毛蕨中所含的主要成分Protoapigenone具有良好的抗腫瘤活性，且對諸多腫瘤細胞都表現(xiàn)出明顯的細胞毒作用。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，由該植物首次提取制備的黃酮類化合物2-(順-1,2-二羥基-4-酮-環(huán)己-5

2、-烯)-5,7-二羥基-色原酮（DEDC）是Protoapigenone的結(jié)構(gòu)類似物，對多種腫瘤細胞也呈現(xiàn)出顯著的增殖抑制活性。
　　 近年來不斷發(fā)現(xiàn)，植物黃酮(flavonoids)集許多優(yōu)良的生理、藥理學活性于一身，在癌癥及心血管疾病的預防、治療方面以其天然、高效、低毒的特點而倍受矚目。黃酮類化合物抗腫瘤機制的報道常常見諸報端，但是總的來說，其具體的防癌、抗癌機理目前尚未明確。近一兩年國外研究者在植物黃酮抗腫瘤研究方面取得了

3、突破性的進展，發(fā)現(xiàn)許多藥物具有的抗氧化與促氧化活性、生物膜保護作用、線粒體毒性損傷、蛋白酶體抑制反應、信號轉(zhuǎn)導抑制與調(diào)節(jié)功能在抗腫瘤效應及誘導腫瘤細胞凋亡方面起關(guān)鍵作用。
　　 植物黃酮結(jié)構(gòu)上屬于多酚類植物化合物，一直被認為是高效的天然抗氧化劑。事實上，植物黃酮作為功能物質(zhì)起效時，同時具有抗氧化與促氧化兩種截然相反的特性。人們通常把植物黃酮對疾病的預防作用歸因于其具有良好的抗氧化活性及自由基清除特性。事實上，這些多酚類化合物在抗

4、癌及誘導腫瘤細胞凋亡方面，其促氧化活性起著比抗氧化更為重要的作用。研究表明，這些植物多酚類物質(zhì)能催化谷胱甘肽(GSH)或輔酶I氧化而產(chǎn)生活性氧（ROS），而許多化療藥物能誘導細胞核DNA片段化引起不可逆損傷并促使腫瘤細胞凋亡都是通過ROS介導產(chǎn)生的。
　　 目前，對于黃酮類化合物DEDC的抗腫瘤作用機制并不十分清楚，認為至少可能包括以下兩個方面：1．DEDC通過在細胞內(nèi)的促氧化作用，造成氧化壓力，引起氧化應激而損傷生物膜、DNA

5、及其它生物大分子誘導腫瘤細胞凋亡。2．通過在較高濃度下產(chǎn)生ROS調(diào)節(jié)某些細胞信號轉(zhuǎn)導途徑，如：絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)；轉(zhuǎn)錄信號傳導子與激活子3（STAT3）；核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）等的活性，繼而調(diào)節(jié)細胞生理過程的各個方面，包括細胞的增殖、分化和凋亡。
　　 本研究用DEDC處理人肝癌細胞HepG2以及人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y后，采用臺盼藍拒染法、MTT比色法、流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)C

6、M）、凝膠電泳遷移實驗（EMSA）、免疫印跡實驗（Western-blot）、和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）等方法分別檢測HepG2及SH-SY5Y細胞在DEDC處理后，細胞DNA損傷情況和凋亡相關(guān)基因及蛋白表達水平的變化。為了進一步闡明ROS及有關(guān)細胞信號分子在腫瘤細胞凋亡中所起的作用，ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)，JNK1/2抑制劑SP600125，P38 MAPK抑制劑SB203580被用于實驗，測定ROS、JNK

7、、P38等信號分子在DEDC誘導的HepG2細胞凋亡中起什么作用；同時，NAC和NF-κB抑制劑PDTC被用于檢測ROS和NF-κB對SH-SY5Y細胞凋亡的影響。
　　 第一部分 DEDC對HepG2細胞毒性作用及其凋亡機制的研究
　　 鑒于黃酮類化合物protoapigenone展示出較強的抗癌活性，本試驗旨在探討其結(jié)構(gòu)類似物2-(順-1,2-二羥基-4-酮-環(huán)己-5-烯)-5,7-二羥基-色原酮 (DEDC)，一種

8、首次從普通針毛蕨分離得到的黃酮類化合物，對肝癌細胞HepG2的生長抑制作用及其誘導凋亡的分子機制，同時為進一步檢測了ROS捕獲劑NAC及MAPK通路抑制劑對DEDC誘導，實驗設計中采取了對細胞預先用不同抑制劑加以處理的方法再觀察腫瘤細胞凋亡效應的變化。
　　 將肝癌細胞HepG2和肝正常細胞LO2分別暴露于DEDC（2.5，5，10μg/ml）或protoapigenone（2.5，5，10μg/ml）24 h后，使用臺盼藍染色

9、法、流式細胞術(shù)、和Western blot技術(shù)檢測了細胞存活率、凋亡百分比、胞內(nèi)ROS積累、線粒體膜電位變化情況及Procaspase-3，-8，-9、Bcl-2家族成員、MAPK通路蛋白等凋亡相關(guān)因子的蛋白表達水平。結(jié)果顯示：
　　 與正常肝細胞相比，肝癌細胞HepG2對DEDC高度敏感（＃P<0.1），而protoapigenone對上述兩種細胞株均有明顯的生長抑制作用。在DEDC處理的HepG2細胞中我們檢測到持續(xù)而快速產(chǎn)

10、生的活性氧自由基ROS并伴隨著細胞膜電位的降低，當細胞用NAC預孵育后ROS水平的升高及細胞電勢的降低則均被取消。從免疫印記實驗可知，在DEDC的處理引起了HepG2細胞中細胞色素C從線粒體向胞漿釋放，Procaspase-3，-8，-9的降解，Bcl-2/Bax比值減小，JNK、P38 MAPK信號傳導途徑的磷酸化激活。細胞分別經(jīng)各抑制劑預處理后，則發(fā)現(xiàn)NAC及JNK特異性抑制劑SP600125顯著地抑制了DEDC誘導的細胞凋亡，而P

11、38特異性抑制劑SB203580則促進了DEDC誘導的凋亡反應。
　　 綜上所述，DEDC在一定劑量水平上能顯著抑制肝癌細胞HepG2的增殖而對肝正常細胞LO2損傷微小，顯示出良好的生物活性。DEDC誘導的凋亡與胞內(nèi)ROS水平上升明顯相關(guān)，而且從免疫印記實驗也證明ROS介導的Bcl-2和Caspase途徑依賴的線粒體功能紊亂是DEDC誘導HepG2細胞凋亡的重要機制。同時，JNK和P38 MAPK信號通路也參與了對凋亡的調(diào)控，但

12、JNK的活化表現(xiàn)為正向調(diào)節(jié)作用而P38 MAPK信號通路則表現(xiàn)為負性調(diào)節(jié)效應。
　　 第二部分 DEDC對SH-SY5Y細胞毒性作用及其凋亡機制的研究
　　 神經(jīng)母細胞瘤是兒童常見的惡性實體腫瘤之一。目前，該病的發(fā)生機制尚不明確，是臨床治療及實驗室研究的熱點和難點。本研究擬探討黃酮類化合物DEDC對神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y增殖活性的影響及信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）、核因子κB（NF-κB）信號轉(zhuǎn)導通路在

13、凋亡過程中的調(diào)節(jié)作用。
　　 將神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y、肺腺癌細胞A549、前列腺癌細胞PC-3、人乳腺癌細胞MCF-7暴露于DEDC（2.5，5，7.5，10μg/ml）24 h后，通過MTT比色法，求出各細胞株的半數(shù)抑制率（IC50值）。凝膠電泳遷移實驗（EMSA）檢測了將SH-SY5Y細胞暴露于DEDC (7.5μg/ml)不同時間（3 h，6 h，12 h，24 h）后，核內(nèi)NF-κB蛋白結(jié)合活性的變化情況。We

14、stern blot檢測了SH-SY5Y細胞暴露于不同濃度的DEDC（2.5，5，7.5，10μg/ml）后，STAT3、NF-κB、p53、p21、Bcl-2、Bax等凋亡相關(guān)蛋白的表達情況。為進一步闡明ROS及NF-κB信號分子在SH-SY5Y細胞凋亡中的作用，我們使用熒光染色法、流式細胞術(shù)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和Western blot技術(shù)對比了存在和不存在ROS捕獲劑NAC或NF-κB特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲

15、酸鹽（PDTC）時，細胞凋亡百分比、細胞周期分布、胞內(nèi)ROS積累、及NF-κB、P53、Bcl-2、Bax等凋亡相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達水平的變化。結(jié)果顯示：四種腫瘤細胞的IC50值范圍從5.2μg/ml到11.5μg/ml，其中SH-SY5Y細胞的IC50值最低，說明該種細胞對DEDC最敏感，因此被選擇作為實驗對象。與對照組比較，DEDC誘導的細胞早期凋亡率、G2/M期阻滯的細胞比例、胞內(nèi)ROS水平的上升均有顯著性差異。DEDC能

16、有效抑制轉(zhuǎn)錄信號傳導子與激活子3（STAT3）通路的異常激活是該化合物誘導腫瘤細胞凋亡的重要機制之一。通過檢測抑制劑對凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)DEDC誘導SH-SY5Y細胞凋亡是胞內(nèi)ROS積累繼而引發(fā)一連串凋亡級聯(lián)反應的結(jié)果，抗氧化劑NAC能顯著抑制ROS的產(chǎn)生并阻斷DEDC誘導凋亡活性；核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）在SH-SY5Y細胞凋亡過程中被活化，而抑制NF-κB通路能顯著增強腫瘤細胞對DEDC促凋亡效應的敏感性，DEDC與PDTC聯(lián)用對

17、引發(fā)SH-SY5Y細胞凋亡呈現(xiàn)明顯的協(xié)同效應。
　　 綜上所述，人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y對DEDC高度敏感，凋亡作用的產(chǎn)生與DEDC能增加腫瘤細胞ROS的積累密切相關(guān)。在凋亡過程中，DEDC通過ROS介導的對STAT3信號轉(zhuǎn)導通路的負性調(diào)節(jié)是該化合物誘導凋亡的重要作用機制；凋亡調(diào)節(jié)蛋白P53、P21、CyclingB1、Bcl-2、Bax均參與了對 SH-SY5Y細胞凋亡的調(diào)控；NF-κB通路被激活在DEDC誘導的細胞凋