PPV SC-1株VP2蛋白Cys-402、214的定點(diǎn)突變及其對(duì)PPV VLPs影響的初步研究.pdf

1、本研究以PPVVP2為基礎(chǔ)，通過(guò)定點(diǎn)突變的方法研究了Cys在VLPs高級(jí)結(jié)構(gòu)和免疫原性中的作用，旨在尋找利于外源基因插入的位點(diǎn)，為以PPVVLPs為基礎(chǔ)的多價(jià)疫苗和抗原轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究提供理論基礎(chǔ)。方法：根據(jù)GenBank中PPVVP2(Genbank登錄號(hào)：D00623)序列設(shè)計(jì)并合成突變引物和克隆引物，利用重疊延伸PCR技術(shù)分別將PPVVP2蛋白中第402位(A)和214位(B)的半胱氨酸突變?yōu)榫彼?。將得到的突變產(chǎn)物VP2(A)和V

2、P2(B)分別插入真核表達(dá)載體pPI-2.EGFP中，構(gòu)建含有突變產(chǎn)物和報(bào)告基因EGFP的真核表達(dá)質(zhì)粒pPI-2.EGFP.VP2(A)和pPI-2.EGFP.VP2(B)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，研究突變對(duì)PPVVLPs形成的影響。同時(shí)將重組質(zhì)粒分別免疫Balb/c小白鼠，監(jiān)測(cè)外周血中T淋巴細(xì)胞及血清中PPV抗體的動(dòng)態(tài)變化，探討突變對(duì)PPVVLPs免疫原性的影響。 通過(guò)電鏡技術(shù)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行觀察，結(jié)果只在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pPI-

3、2.EGFP.VP2(A)的細(xì)胞中見(jiàn)到許多VLPs，證明Cys-214對(duì)VLPs的形成至關(guān)重要，而Cys-402的突變不會(huì)影響VLPs的包裝；在免疫小白鼠外周血T淋巴細(xì)胞的監(jiān)測(cè)和血清中特異性抗體的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒pPI-2.EGFP.VP2(B)的免疫效果明顯低于pPI-2.EGFP.VP2(A)，并且僅在免疫了質(zhì)粒pPI-2.EGFP.VP2(A)的小白鼠血清中檢測(cè)到較高水平的PPV特異性抗體，說(shuō)明Cys-402的突變不僅不影響VLP