探討PTEN作為肝內(nèi)膽管癌個(gè)性化治療靶標(biāo)的研究.pdf

1、肝內(nèi)膽管癌(ICC)是指左右膽管匯合部以上的膽管上皮起源的惡性腫瘤。在臨床中表現(xiàn)為潛伏期長(zhǎng)，惡性程度高，放化療抵抗，預(yù)后差等。同時(shí)，肝內(nèi)膽管癌在病因和發(fā)病機(jī)制上研究不是很深入，缺乏明確的分子指標(biāo)1。流行病學(xué)資料顯示近三十年來肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病率持續(xù)上升;與此同時(shí)，隨著研究的深入，人們對(duì)參與ICC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制也有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。外顯子測(cè)序顯示P53，KRAS，SMAD4，IHD等是在肝內(nèi)膽管癌中常常突變或激活的基因，對(duì)其惡性進(jìn)程影響

2、重大。
　　PTEN，全稱是磷酸酶與張力蛋白同源蛋白。1997年被兩個(gè)獨(dú)立的課題組發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)，是繼P53之后發(fā)現(xiàn)的最重要的抑癌基因2，3。在多種腫瘤中，磷酸酶與張力蛋白同源蛋白PTEN功能的重要性是因?yàn)槠淙笔?，下調(diào)或突變而顯現(xiàn)出來的。PTEN通過自身脂質(zhì)磷酸酶活性，拮抗PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞多種生理進(jìn)程，包括:存活，增殖，能量代謝，細(xì)胞骨架構(gòu)建以及細(xì)胞間相互識(shí)別。因此，調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)和功能的機(jī)制，在腫瘤發(fā)生

3、發(fā)展中尤其重要4。值得注意的是，隨著對(duì)PTEN功能認(rèn)識(shí)的深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中PTEN缺失與否直接關(guān)系著對(duì)放化療藥物和抑制劑的敏感性，有文章指出PTEN的缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞基因組不穩(wěn)定，這種不穩(wěn)定性恰好適用于某些藥物，從而可以實(shí)現(xiàn)以PTEN為基礎(chǔ)的個(gè)性化治療。
　　我們的工作正是得到上述研究的啟發(fā)，開展了PTEN在肝內(nèi)膽管癌中的功能探索。首先通過cDNA測(cè)序法檢測(cè)肝內(nèi)膽管癌組織，發(fā)現(xiàn)PTEN有突變，盡管這隨后被證明為PTE

4、N的假基因（PTENp1），但也側(cè)面反應(yīng)了PTEN真基因的缺失;對(duì)PTEN的外顯子進(jìn)行PCR測(cè)序發(fā)現(xiàn)，ICC細(xì)胞系HCCC-9810有外顯子的缺失，導(dǎo)致全長(zhǎng)PTEN的mRNA不能被轉(zhuǎn)錄出來。同時(shí)通過Western Blot和免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)PTEN的確在肝內(nèi)膽管癌組織和細(xì)胞系中存在缺失;結(jié)合臨床資料，我們發(fā)現(xiàn)PTEN的表達(dá)量與ICC患者的預(yù)后相關(guān)，高表達(dá)PTEN組的患者預(yù)后更好。更有意義的是，PTEN的缺失導(dǎo)致它們對(duì)于回補(bǔ)PTEN反應(yīng)

5、性不同:PTEN野生型的ICC細(xì)胞發(fā)生抵抗，PTEN突變?nèi)笔偷募?xì)胞出現(xiàn)死亡;這在基于病人來源的腫瘤異種移植PDX模型中得到很好的驗(yàn)。同時(shí)，PTEN缺失的ICC腫瘤對(duì)化療藥物吉西他濱(GEM)和小分子抑制劑Bortezomib和Rapamycin更為敏感。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1、對(duì)肝內(nèi)膽管癌組織和細(xì)胞系進(jìn)行cDNA和基因組外顯子PCR擴(kuò)增后測(cè)序，檢測(cè)是否存在突變;
　　2、用蛋白免疫印跡法和免疫組化檢測(cè)肝內(nèi)膽管癌組織

6、和細(xì)胞系中PTEN表達(dá)情況;
　　3、統(tǒng)計(jì)和分析127例ICC腫瘤組織的石蠟切片PTEN免疫組化結(jié)果;
　　4、檢測(cè)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系HCCC-9810和RBE增殖遷移能力;觀察兩種細(xì)胞對(duì)恢復(fù)PTEN表達(dá)的反應(yīng);用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)處理后的細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡;加入Akt抑制劑LY294002，凋亡抑制劑z-VAD，壞死抑制劑Necrostatin1后檢測(cè)細(xì)胞變化情況。
　　5、基因芯片分析兩種細(xì)胞系PTEN過表達(dá)后的基因變

7、化;用WesternBlotting檢測(cè)PTEN過表達(dá)影響的信號(hào)通路;
　　6、在ICC腫瘤細(xì)胞系RBE和HCCC-9810中過表達(dá)PTEN，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)泛素化水平;在HEK-293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)HA標(biāo)簽的泛素和PTEN的質(zhì)粒，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)泛素化水平。
　　7、用溶酶體探針Lysotracker和外轉(zhuǎn)GFP-LC3質(zhì)粒檢測(cè)RBE和HCCC-9810細(xì)胞過表達(dá)PTEN的自噬-溶酶體變化情況;
　　8、在RBE和HCCC-981

8、0細(xì)胞系中加入蛋白酶體抑制劑MG132和自噬激活劑Rapamycin，檢測(cè)細(xì)胞存活情況;
　　9、在RBE和HCCC-9810細(xì)胞中過表達(dá)PTEN后，加入不同信號(hào)通路的抑制劑，檢測(cè)細(xì)胞的存活情況。
　　10、在人源腫瘤異種移植PDX模型中，瘤內(nèi)注射PTEN腺病毒，檢測(cè)PTEN對(duì)于ICC腫瘤的治療作用;另外，在該動(dòng)物模型中腹腔注射吉西他濱(GEM)，檢測(cè)不同PTEN背景ICC腫瘤的反應(yīng)性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、

9、PTEN在ICC腫瘤組織和細(xì)胞系中存在突變;
　　2、PTEN表達(dá)量在部分ICC腫瘤組織和細(xì)胞系中發(fā)生缺失和下調(diào);在ICC細(xì)胞系中，RBE為PTEN野生型，HCCC-9810為PTEN缺失型;
　　3、PTEN的表達(dá)和ICC患者預(yù)后存活相關(guān)，PTEN表達(dá)高組的患者中位無瘤存活時(shí)間和中位總體存活時(shí)間更長(zhǎng);
　　4、RBE和HCC-9810細(xì)胞系在增殖遷移等基本生命過程中差別不大;但是當(dāng)回補(bǔ)PTEN后，HCCC-9810出

10、現(xiàn)死亡，且不完全依賴于PI3K-Akt信號(hào)通路的抑制;RBE細(xì)胞對(duì)于PTEN回補(bǔ)反應(yīng)性不大。
　　5、基因芯片顯示HCCC-9810細(xì)胞PTEN過表達(dá)后細(xì)胞周期和DNA復(fù)制受到抑制，同RBE相比，HCCC-9810細(xì)胞中溶酶體功能上調(diào)，泛素—蛋白酶體功能下調(diào)是比較特異的、可能導(dǎo)致死亡的原因;Western Bloting也顯示同樣的結(jié)果。
　　6、HCCC-9810細(xì)胞過表達(dá)PTEN后，泛素化水平降低;該過程依賴PTEN的酶

11、活性，包括質(zhì)粒磷酸酶和蛋白磷酸酶活性。
　　7、在ICC細(xì)胞系中，PTEN能夠激活溶酶體功能，促進(jìn)細(xì)胞自噬，該過程不完全依賴其酶活性。
　　8、在HCCC-9810細(xì)胞中，同時(shí)激活自噬和抑制泛素-蛋白酶體功能，將會(huì)導(dǎo)致其死亡，而RBE中無明顯變化。
　　9、CQ（溶酶體抑制劑），Sal（PERK抑制劑，抑制ER stress），Necro（RIP3抑制劑，抑制細(xì)胞壞死），z-VAD（Caspase抑制劑，抑制細(xì)胞凋亡）

12、對(duì)PTEN介導(dǎo)的9810細(xì)胞死亡有一定的拮抗作用。
　　10、PDX模型中，PTEN野生型的ICC腫瘤對(duì)PTEN腺病毒介導(dǎo)的治療效果不佳，而PTEN缺失型ICC腫瘤則有很好的治療效果;同時(shí)，吉西他濱對(duì)PTEN缺失的ICC腫瘤治療效果良好。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:研究中發(fā)現(xiàn)，PTEN在肝內(nèi)膽管癌中突變，這種突變將導(dǎo)致蛋白表達(dá)缺失;PTEN的表達(dá)影響ICC腫瘤患者的預(yù)后，PTEN高表達(dá)組的患者預(yù)更好;PTEN通過激活溶酶體，促進(jìn)自噬，抑