SARS冠狀病毒S蛋白表位的篩選、診斷抗原的制備和免疫活性研究.pdf

1、目的：分析篩選SARS冠狀病毒(SARSassociatedcoronavirus，SARS-CoV)S蛋白的抗原表位，分別采用人工合成抗原肽和基因表達(dá)方法獲取抗原蛋白并對(duì)其免疫原性和免疫反應(yīng)性進(jìn)行分析，為診斷SARS-CoV的早期感染、排查疑似病例和大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查的檢測(cè)試劑盒的制備奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：通過(guò)生物信息學(xué)方法分析SARS-CoV主要結(jié)構(gòu)蛋白，用多參數(shù)預(yù)測(cè)其B細(xì)胞表位，從S蛋白中篩選出保守、特異的表位，在S1和S

2、2蛋白部分各合成一段均為28aa的多肽(peptide1和peptide2)；同時(shí)合成S1部分一段801bp(304aa～571aa)的基因片段克隆到pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，藍(lán)白篩選挑取陽(yáng)性重組子pUCm-T/SARS-S1進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶酶切、PCR及測(cè)序鑒定，并對(duì)測(cè)序結(jié)果用Blast軟件進(jìn)行分析。pUCm-T/SARS-S1經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ雙酶切，回收酶切目的片段并定向克隆至原核細(xì)胞表達(dá)載體pET

3、-28b(+)，PCR、雙酶切和通用引物測(cè)序鑒定。重組子pET-28b/SARS-S1轉(zhuǎn)化E.coliril后，以1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并用SDS-PAGE和Westernblot鑒定表達(dá)產(chǎn)物(rSARS-S1)，經(jīng)三種方法洗滌包涵體后，采用Ni-NTASpinkit對(duì)沉淀中的融合蛋白在變性條件下進(jìn)行純化，用急性期或恢復(fù)期SARS-CoV患者血清檢測(cè)產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性。將獲得的抗原免疫新西蘭兔制備其相應(yīng)多克隆抗體并純化，用ELISA和W

4、esternblot鑒定其識(shí)別peptide1、SARS-S1表達(dá)蛋白、SARS-CoV及其裂解產(chǎn)物的特異性。 結(jié)果：人工合成了兩段多肽并制備了其多克隆抗體(分別命名為Ab1、Ab2)；將合成的801bp的S1部分核苷酸插入pUCm-T克隆載體，經(jīng)核酸序列測(cè)定分析，與GeneBank公布的序列完全一致；回收酶切目的片段S1并定向克隆至原核細(xì)胞表達(dá)載體pET-28b(+)，pET-28b/SARS-S1經(jīng)BamHⅠ、SalⅠ雙酶切

5、酶切鑒定表明，插入序列與PCR擴(kuò)增序列相符；pET-28b/SARS-S1轉(zhuǎn)化E.coliril，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，37℃下5h達(dá)到最高的表達(dá)量(47％)，主要為包涵體形式存在的32kD的目的蛋白(rSARS-S1)，與預(yù)期蛋白大小一致，Westernblot鑒定其為帶組氨酸標(biāo)簽(6-His)的融合蛋白：經(jīng)三種方法洗滌包涵體，得到純度大于90％的rSARS-S1，經(jīng)Ni-NTASpinKit鎳離子親和純化獲得了大于95％的純化蛋白rS

6、ARS-S1；ELISA試驗(yàn)證明其能與合成肽peptide1的抗體Ab1反應(yīng)，而與peptide2的抗體Ab2不能結(jié)合；rSARS-S1能與急性期或恢復(fù)期SARS-CoV患者血清反應(yīng)，而合成肽不能；rSARS-S1的免疫血清能與peptide1和rSARS-S1反應(yīng)，效價(jià)均在1：640以上。 結(jié)論：成功構(gòu)建了SARS-S1基因片段的原核表達(dá)載體pET-28b/SARS-S1，并在E.coliril中高效表達(dá)出相對(duì)分子量約為32k