生物毒素響應(yīng)智能水凝膠的構(gòu)建及其可視化定量檢測體系.pdf

1、生物毒素對人類生命健康具有較大的威脅，高靈敏、高特異性的分析平臺亟待建立。目前，常用的分析平臺包括液相色譜、質(zhì)譜等儀器分析法，以及免疫分析法。前者雖然靈敏度高，但是分析儀器價格昂貴，且對操作者的專業(yè)技術(shù)水平要求較高，不適用于推廣至每個實驗室或單位進行檢測;以ELISA為代表的免疫分析方法，具有較高的靈敏度和便攜、易操作等優(yōu)點，但是受限于抗體的不穩(wěn)定性、批間差異大、難于制備等缺點。在建立檢測分析方法方面，核酸適體擁有與抗體相媲美的親和性的

2、同時又有許多優(yōu)勢，它具有合成簡便、穩(wěn)定、易于修飾、無免疫原性以及靶分子較為廣泛等諸多優(yōu)點，是潛在的抗體替代物。核酸適體智能水凝膠不僅可以進行高靈敏、高特異性的檢測，還具有快速、便攜、價格低廉等優(yōu)點，尤其適合需求現(xiàn)場檢測的場合?；诤怂徇m體的智能水凝膠所建立的可視化定量檢測傳感器為生物毒素分析提供了新的發(fā)展方向，在生化分析毒素檢測領(lǐng)域顯示出極大的應(yīng)用前景。因此本論文圍繞生物毒素智能水凝膠，開展了以下四方面的工作:
　　(1)赭曲霉素

3、A響應(yīng)的核酸適體水凝膠的制備與表征
　　OTA具有腎臟毒性、致癌、致畸以及抑制免疫力等危害人類身體健康的毒性。我們選擇Cruz-Aguado小組篩選獲得的OTA aptamer（Aptamer1.12.2）為水凝膠的交聯(lián)劑，設(shè)計兩條與其互補的聚合單鏈，構(gòu)建了第一個生物毒素核酸適體水凝膠即OTA響應(yīng)的核酸適體水凝膠。首先，甲基丙烯基酰胺單體修飾的DNA根據(jù)自由基聚合的機理聚合為含有DNA鏈的線狀高分子聚合產(chǎn)物(PS-A和PS-B);

4、 PS-A和PS-B由于設(shè)計含有與OTA核酸適體部分互補序列，通過堿基互補配對，可以雜交成為三維網(wǎng)狀的水凝膠，并采用金顆粒可視化的方法對水凝膠的成膠與刺激解膠進行表征，初步獲得了可視化檢測OTA的靈敏度和選擇性。
　　(2)基于氣動芯片和核酸適體水凝膠的赭曲霉素A的便攜定量檢測體系
　　基于金顆粒的可視化檢測方法雖然便攜，但是只能提供半定量或定性的分析結(jié)果，無法滿足精確定量的檢測需求，因而限制了其在實際檢測中的應(yīng)用。為了建立

5、既便攜又精確定量OTA檢測平臺，我們將一種氣動芯片與包埋有催化能力的鉑包金顆粒水凝膠體系結(jié)合。作為一種信號讀出方式，氣動芯片將OTA的濃度與氣體壓強相關(guān)聯(lián)。芯片內(nèi)部的顏色液體在氣壓的推動下前進的距離與OTA的濃度呈正相關(guān)關(guān)系，又因預(yù)包埋的鉑包金顆粒有催化放大能力，進一步降低水凝膠檢測限。并與OTA的免疫親和柱聯(lián)用，我們實現(xiàn)了啤酒樣品中痕量OTA的檢測，靈敏度為0.5μg/kg，滿足歐盟組織限定標準檢測限(2μg/kg)。由此，我們成功建

6、立了基于水凝膠的OTA的可視化定量檢測體系。
　　(3)基于核酸適體的無標記納米金可視化檢測黃曲霉毒素B1
　　黃曲霉毒素B1(AFB1)是目前毒性最強的小分子真菌毒素，廣泛存在于糧食和畜禽飼料中，對人的生命健康造成極大的危害。因此對AFB1開展有效的快速檢測具有重要的意義。基于無標記金顆?？梢暬暮怂徇m體傳感器，具有便攜、快速等優(yōu)點，適合現(xiàn)場即時檢測。我們將本課題組篩選得到的AFB1核酸適體對高鹽體系中的金顆粒進行保護，如

7、果溶液中存在AFB1，AFB1與核酸適體結(jié)合使得金顆粒脫保護而產(chǎn)生顏色變化，根據(jù)金顆粒溶液顏色的變化進行可視化半定量檢測AFB1。雖然方法簡便，但是體系的靈敏度較低，無法滿足AFB1實際樣品的檢測分析，所以需要對該方法進行改進。
　　(4)黃曲霉素核酸適體的變構(gòu)篩選
　　無標記金顆?？梢暬瘷z測AFB1存在體系穩(wěn)定性差、靈敏度低等缺陷，鑒于OTA響應(yīng)的核酸適體水凝膠及其可視化定量檢測體系的成功構(gòu)建，我們設(shè)想可以發(fā)展AFB1響應(yīng)