肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)廢用性骨骼肌萎縮細(xì)胞凋亡與增殖的影響.pdf

1、研究背景 肢體制動(dòng)是骨關(guān)節(jié)病損的一種主要治療手段，由此帶來(lái)的骨骼肌廢用性萎縮嚴(yán)重的影響了疾病的治療和功能的恢復(fù)。廢用性骨骼肌萎縮一旦發(fā)生，其恢復(fù)是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，對(duì)于肌力、肢體功能以及日常生活都會(huì)產(chǎn)生較大的影響，在某些情況下其危害性甚至超過(guò)了原發(fā)病。尤其現(xiàn)今交通傷，意外事故的發(fā)生每年呈幾倍增長(zhǎng)的趨勢(shì)，臨床上重型損傷的案例也在逐年增長(zhǎng)，這種情況更是日益明顯，對(duì)患者的恢復(fù)產(chǎn)生滯后因素，甚至留下嚴(yán)重的后遺癥。面對(duì)廣大患者，對(duì)肌萎縮的早

2、期預(yù)防和治療也就顯得更加重要了。 目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于廢用性骨骼肌萎縮治療的研究主要集中在運(yùn)動(dòng)治療、物理治療和藥物治療這三個(gè)方面。然而，在臨床實(shí)踐過(guò)程中，對(duì)于那些組織嚴(yán)重受損的患者則需長(zhǎng)期制動(dòng)，在這種情況下進(jìn)行運(yùn)動(dòng)治療和物理治療在治療的早期顯然不可取，那樣只會(huì)加重病情；藥物療法雖然通過(guò)不同的機(jī)制作用于骨骼肌，起到一定的作用，但是由于缺乏針對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)的特異性，療效始終不理想。在廢用性骨骼肌萎縮防治的研究中，骨骼肌的再生機(jī)制已經(jīng)成為我

3、們研究的重點(diǎn)，其中骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的作用越來(lái)越受到關(guān)注。1971年Moss和Leblond首次證實(shí)，肌核數(shù)目的增加是由于衛(wèi)星細(xì)胞的分裂及隨后子細(xì)胞的融合所致。30年來(lái)大量的研究證實(shí)，衛(wèi)星細(xì)胞是唯一的生肌干細(xì)胞的來(lái)源。Lipton發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星細(xì)胞能夠沿著基膜遷移，并能穿過(guò)基膜進(jìn)行融合，這也是首次獲得的由衛(wèi)星細(xì)胞提供宿主肌細(xì)胞核的證據(jù)。如今，對(duì)于衛(wèi)星細(xì)胞的研究已經(jīng)進(jìn)入分子水平，各種促衛(wèi)星細(xì)胞分裂的生長(zhǎng)因子的生肌作用研究也已深入開(kāi)展，然而已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的

4、促生肌因子只能對(duì)已開(kāi)始分裂的衛(wèi)星細(xì)胞起作用，卻不能迅速激活修補(bǔ)損傷所需的大量衛(wèi)星細(xì)胞，而成纖維細(xì)胞分裂迅速，纖維組織的生長(zhǎng)快于肌組織，所以肌組織形態(tài)和功能的恢復(fù)就非常不理想了。因此，尋找一種更為有效的生長(zhǎng)因子便成為學(xué)者們迫切解決的問(wèn)題。 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是1984年NaKamura等學(xué)者從部分肝切除大鼠的血清中分離到一種能刺激原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞生長(zhǎng)和合成的肝源性因子，并首次將它命名為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。HGF是一種多

5、功能細(xì)胞因子，其作用無(wú)種屬特異性，但有器官特異性，此特異性可能與HGF通過(guò)受體發(fā)揮作用有關(guān)。有研究顯示，創(chuàng)傷后處于修復(fù)期的肌組織內(nèi)含有大量HGF，這都提示HGF有可能負(fù)責(zé)激活衛(wèi)星細(xì)胞，促進(jìn)正在修復(fù)和再生的肌組織內(nèi)成肌前體細(xì)胞分裂增殖。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體內(nèi)增殖分化雖然受IGFs、EGF、HGF等多種生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)，但是IGFs、EGF僅能增強(qiáng)已激活的衛(wèi)星細(xì)胞的增殖能力，對(duì)處于靜止期的衛(wèi)星細(xì)胞沒(méi)有作用，HGF是唯一能激活靜止期衛(wèi)星細(xì)胞的生長(zhǎng)因子

6、，它與c-Met作用后，能使處于靜止期的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞退出G0期，進(jìn)入S期開(kāi)始分裂。國(guó)內(nèi)也有相關(guān)實(shí)驗(yàn)報(bào)道證實(shí)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子與表皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維生長(zhǎng)因子這兩種對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞促增殖作用較強(qiáng)的生長(zhǎng)因子相比較，其增殖作用更為明顯，且價(jià)格較其他因子而低廉，獲取方便，更適合于臨床。 目的 目前，國(guó)內(nèi)外就肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在骨骼肌廢用性萎縮防治中的作用方面還未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)欲通過(guò)利用其在骨骼肌再生過(guò)程中這種對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞增殖調(diào)控的特

7、殊性能，用于干預(yù)肢體固定后骨骼肌廢用性萎縮，觀察其對(duì)骨骼肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變以及骨骼肌細(xì)胞凋亡和衛(wèi)星細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)的影響，初步探討肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)骨骼肌廢用性萎縮防治的影響，給廢用性骨骼肌萎縮的治療提供新的思路和方法，為進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)化為臨床治療的方法提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。 材料和方法 我們將雄性Wistar大鼠24只隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各8只。將對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組按照J(rèn)ozsa的方法，將大鼠右后肢用可塑性

8、石膏由足跖處管型固定至膝上1cm處，膝關(guān)節(jié)固定于屈曲位1000，踝關(guān)節(jié)固定于跖屈600，以便小腿肌肉保持松弛位。石膏浸液摻入苦味素以防大鼠啃咬。實(shí)驗(yàn)組于制動(dòng)當(dāng)天起將肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子制成10mg/ml的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子溶液，按大鼠體重10mg/kg注射入大鼠腓腸肌(每只0.20-0.25ml)，每天1次，共注射28天。對(duì)照組則注射等量生理鹽水。正常組不予任何處理，自由飼養(yǎng)。四周后，由肌肉的起點(diǎn)至止點(diǎn)完整取出大鼠右后肢腓腸肌。各組標(biāo)本以多聚甲醛

9、固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色、光鏡觀察；電鏡標(biāo)本以30g/L戊二醛-10g/L鋨酸雙重固定，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛電子染色，透射電鏡觀察肌肉組織超微結(jié)構(gòu)的變化。 對(duì)骨骼肌細(xì)胞凋亡的測(cè)定我們采用DNA末端原位標(biāo)記法(TUNEL法)來(lái)標(biāo)記，并對(duì)bcl-2單克隆抗體進(jìn)行測(cè)定。DNA末端原位標(biāo)記法光鏡下顯示凋亡的骨骼肌細(xì)胞的胞核呈深淺不一的棕黃色，而正常骨骼肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，按此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定是否為凋亡的骨骼肌細(xì)胞。

10、在400倍的光鏡下，將被觀察的每張切片隨機(jī)檢測(cè)10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的凋亡指數(shù)(apoptoticindex，AI)，并計(jì)算出平均AI值，以此平均AI值作為該片凋亡指數(shù)。而bcl-2單克隆抗體則通過(guò)免疫組化染色法進(jìn)行測(cè)定。其染色模式為胞質(zhì)，光鏡下顯示棕黃色為bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞，采用Leica-Q500MC圖象分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。 對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)的影響，我們通過(guò)其對(duì)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和核

11、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白表達(dá)的影響來(lái)測(cè)定。二者皆采用免疫組化染色法。PCNA染色模式為胞核，光鏡下棕黃色為PCNA陽(yáng)性細(xì)胞。NF-κB蛋白染色模式為胞核，光鏡下棕黃色為NF-κB蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，二者均采用Leica-Q500MC圖象分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理使用spss10.0。所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，統(tǒng)計(jì)方法采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的多個(gè)樣本均數(shù)的方差分析(one-wayANOVA)，組間兩兩比較

12、用SNK法，顯著性水平α=0.05。 研究結(jié)果 1.光鏡觀察結(jié)果：對(duì)照組明顯萎縮改變，肌纖維明顯變細(xì)、變少、間隙增寬，橫紋模糊不清，肌細(xì)胞核增多。肌纖維間結(jié)締組織增多。實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組肌纖維束完整，排列緊密、數(shù)量明顯增多而且較粗，橫紋清楚的肌纖維和肌核也較多。 2.電鏡觀察結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組肌纖維萎縮較對(duì)照組輕；肌纖維肌絲、肌節(jié)的排列、細(xì)胞器的改變較輕，也可見(jiàn)內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體腫脹以及成纖維細(xì)胞、膠原纖維細(xì)胞增生，但均

13、較對(duì)照組少見(jiàn)；而且可見(jiàn)再生的肌細(xì)胞，其肌膜較光滑、核大，有的再生的肌纖維內(nèi)已有較完整的肌絲、肌節(jié)。 3.細(xì)胞凋亡結(jié)果：TUNEL法圖象顯示對(duì)照組凋亡肌細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞核呈深淺不一的棕黃色，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯減少。實(shí)驗(yàn)組、正常組和對(duì)照組的平均凋亡指數(shù)分別為20.38±1.92、8.25±1.67、31.5±2.45。將實(shí)驗(yàn)組分別與正常組和對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，P均小于0.01，可以看出實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的凋亡指數(shù)差異有顯著性，具

14、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；bcl-2單克隆抗體圖象顯示實(shí)驗(yàn)組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組表達(dá)明顯減少。實(shí)驗(yàn)組、正常組和對(duì)照組的平均PU值分別為3.30±0.30、0.80±0.27、2.96±0.21。將實(shí)驗(yàn)組分別與正常組和對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，P均小于0.01。因此，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的平均PU值差異具有顯著性，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)影響的結(jié)果：增殖細(xì)胞核抗原圖象顯示，實(shí)驗(yàn)組肌細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，明顯高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組、正

15、常組和對(duì)照組的平均PU值分別為7.11±0.61、1.81±0.44、4.95±0.55。將實(shí)驗(yàn)組分別與正常組和對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，P均小于0.01，可以看出實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的PU值差異有顯著性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白圖象顯示，實(shí)驗(yàn)組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組表達(dá)明顯減少。實(shí)驗(yàn)組、正常組和對(duì)照組的平均PU值分別為3.54±0.34、0.55±0.24、2.47±0.29。將實(shí)驗(yàn)組分別與正常組和對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，P

16、均小于0.01。因此，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的PU值差異具有顯著性，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1.肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在廢用性骨骼肌萎縮的防治過(guò)程中能明顯增強(qiáng)bcl-2單克隆抗體的表達(dá)，并有效抑制骨骼肌細(xì)胞的凋亡。 2.肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在廢用性骨骼肌萎縮的防治過(guò)程中能明顯提高骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的再生，并增強(qiáng)增殖細(xì)胞核抗原與核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白的表達(dá)。 3.肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在廢用性骨骼肌萎縮的防治過(guò)程中能明顯提高萎縮骨骼肌細(xì)