NM23對PDGF-A啟動子成分的切割、轉(zhuǎn)錄抑制及含nm23重組腺病毒的構(gòu)建.pdf

1、該文利用5,SHS的C豐富鏈(py)篩選Hela細胞cDNA表達文庫發(fā)現(xiàn)三個cDNA克隆,均編碼NM23-H1——一個在乳房癌和黑素瘤中具抑制腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的蛋白.為研究NM23抑制轉(zhuǎn)錄及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的可能作用機制,進行了下列實驗:1.重組人NM23蛋白的表達、純化用含有nm23-H1或nm23-H2基因的pET3C質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導表達重組人NM23-H1和NM23-H2蛋白,經(jīng)硫酸鉸分級分離、純化柱(DE

2、AE-Sephacel,HTP)純化,得到純度高于95﹪的蛋白.2.重組人NM23蛋白對5'SHS、NHE成分的切割及其轉(zhuǎn)錄抑制活性分析用EMSA方法分析了重組人NM23-H1和NM23-H2對5'SHS、NHE的DMA結(jié)合及切割活性,測定了切割位點,分析了切割模式.3.含人nm23基因的重組腺病毒的構(gòu)建與擴增純化應用PCR和DNA重組技術(shù),將nm23 cDNA克隆到pCRⅡ 擴增載體中并測序,再將目的片段亞克隆到真核表達載體pCI中,

3、用BglⅢ、ClaI將目的片段(包括CMV強啟動子、內(nèi)含子、nm23基因、IRES、hgfp基因、SV40 polyA)切下,連接入腺病毒穿棱載體pAdLink中,然后用NheI線性化nm23/pAdLink質(zhì)粒,將其與ClaI線性化的野生型腺病毒dl327共轉(zhuǎn)染293細胞,通過在熒光顯微鏡下觀察發(fā)出綠色熒光的情況及Southern blot方法鑒定、篩選出發(fā)生了正確重組的含有nm23基因的重組腺病毒.大規(guī)模擴增重組腺病毒并用Vira-