SMADs基因在小鼠內(nèi)耳聽覺器官發(fā)育中的信號調(diào)控作用.pdf

1、耳聾在人群中有很高的發(fā)病率。近幾年，遺傳性耳聾研究飛速的發(fā)展。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多的耳聾相關(guān)基因，這些研究成果使得破解聽覺基因，詮釋聽覺系統(tǒng)的分子機(jī)制成為可能。但是，有時由于缺少臨床特性，耳聾遺傳異質(zhì)性及家系比較小等原因，很難完全鑒別出相關(guān)基因。此外，某些相關(guān)基因由于缺少合適的家系進(jìn)行連鎖分析，也使得發(fā)現(xiàn)重要基因很困難。小鼠的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)，發(fā)育及導(dǎo)致聽力損失的病理學(xué)改變與人類極為相似。因此，小鼠耳聾相關(guān)性基因研究提供了另一種方法來鑒定出可能的

2、耳聾基因座。Smad4、Smad5基因是參與轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)家族信號下游的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，主要介導(dǎo)BMP4的信號。早前的研究證實，TGF-β家族成員在動物體內(nèi)廣泛參與調(diào)節(jié)各胚層的發(fā)育、器官的形成、上皮組織的增生、細(xì)胞外基質(zhì)的合成、免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)過程。已研究表明，BMP信號分子家族成員及他們的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在雞、小鼠、斑馬魚和非洲蟾蜍的內(nèi)耳發(fā)育中均有表達(dá)，本課題組發(fā)現(xiàn)Smad4、Smad5基因剔除導(dǎo)致小鼠嚴(yán)重聽力障

3、礙，而且內(nèi)耳聽覺器官包括毛細(xì)胞、支持細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)等出現(xiàn)不同程度的損害，表明，Smad4、Smad5基因可能是聽功能相關(guān)基因。但是，Smad4、Smad5基因?qū)?nèi)耳胚胎具體作用部位、作用時間及作用機(jī)制，尚未見報道。因此本研究對小鼠內(nèi)耳聽覺器官發(fā)育過程進(jìn)行了動態(tài)觀察，對小鼠內(nèi)耳聽覺器官發(fā)育形態(tài)進(jìn)行了觀察，并且初步比較了常用兩種品系小鼠發(fā)育的異同點，通過毛細(xì)胞特異性標(biāo)記物MyosinⅥ進(jìn)一步觀察毛細(xì)胞發(fā)育過程。利用免疫組化方法對BMP4、

4、Smad4、Smad5基因在內(nèi)耳發(fā)育中可能的信號傳導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行了探討。 第一部分：小鼠內(nèi)耳聽覺器官發(fā)育過程研究 目的:研究國內(nèi)最常用兩種品系小鼠內(nèi)耳聽覺器官發(fā)育演變過程，為研究內(nèi)耳發(fā)育選擇合適品系小鼠提供依據(jù)。 方法：選用耳廓反應(yīng)靈敏、健康的C57BL/6小鼠和昆明白種小鼠分別作為種鼠交配，用觀察陰栓方法獲得適齡胎鼠，≤18天取胚胎頭，≥19天在顯微鏡下取耳蝸，胚胎頭水平冰凍切片，耳蝸平行于蝸軸冰凍切片，HE染色方

5、法觀察小鼠耳蝸發(fā)育形態(tài)演變過程。應(yīng)用：Myosin Ⅵ免疫熒光化學(xué)方法標(biāo)記毛細(xì)胞。 結(jié)果：昆明白種小鼠和C57BL/6小鼠內(nèi)耳發(fā)育過程基本相似，但昆明白種小鼠的內(nèi)耳發(fā)育時間比C57BL/6小鼠晚一天。HE染色觀察C57BL/6小鼠，胚胎第10天，聽泡發(fā)育，胚胎12天聽泡下部有蝸管始基形成并開始發(fā)育。胚胎第17天，蝸管基底部外側(cè)形成可辨認(rèn)的毛細(xì)胞，耳蝸底轉(zhuǎn)未來形成Corti隧道的部位變的比較明顯，并且血管紋開始分化。小鼠剛出生時底

6、轉(zhuǎn)的Corti器形態(tài)已接近成熟，基底膜仍較厚，Corti器隧道尚未形成，血管紋已發(fā)育。出生后第8天，Corti隧道變寬。出生后第10天，Nuel間隙形成，耳蝸形態(tài)發(fā)育基本成熟。MyosinⅥ免疫熒光從胚胎17天開始在毛細(xì)胞陽性表達(dá)。 結(jié)論：內(nèi)耳聽覺器官發(fā)育具有一定的規(guī)律，昆明白種小鼠和C57BL/6小鼠內(nèi)耳發(fā)育過程基本相似，但昆明白種小鼠的內(nèi)耳發(fā)育時間晚一天。近交系小鼠基因型更純合一致，故第二部分實驗動物選擇C57BL/6小鼠。

7、 第二部分 Smad4/Smad5基因在小鼠內(nèi)耳聽覺器官發(fā)育中的信號調(diào)控作用 目的：研究Smad4/Smad5基因在小鼠內(nèi)耳耳蝸發(fā)育過程中的作用及可能的作用機(jī)制以及與BMP4的關(guān)系。 方法：選用耳廓反應(yīng)靈敏、健康的C57BL/6小鼠作為種鼠交配，用觀察陰栓方法獲得胚胎9天到20天的胎鼠，≤18天取胚胎頭，≥19天在顯微鏡下取耳蝸，胚胎頭水平冰凍切片，耳蝸平行于蝸軸冰凍切片，HE染色方法觀察小鼠內(nèi)耳發(fā)育形態(tài)演變過程

8、，免疫組織化學(xué)方法檢測Smad4、Smad5、BMP4基因蛋白在小鼠胚胎第10天到出生后14天的表達(dá)情況。 結(jié)果：BMP4和Smad5在小鼠內(nèi)耳聽覺器官的整個發(fā)育過程中均有表達(dá)。表達(dá)的部位及表達(dá)程度基本一致，在聽囊期，表達(dá)遍及整個聽囊上皮。內(nèi)耳聽覺器官胚胎分化及成熟初期表達(dá)主要集中在將發(fā)育成感覺細(xì)胞及支持細(xì)胞的部分；耳蝸胚胎發(fā)育成熟期開始，表達(dá)明顯，在內(nèi)耳耳蝸均有表達(dá)，主要表達(dá)在內(nèi)外毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、支持細(xì)胞、血管紋、基底

9、膜、前庭膜等，骨蝸管及蝸軸的表達(dá)最為強(qiáng)烈。到出生時，耳蝸大體結(jié)構(gòu)發(fā)育基本形成，前庭膜、蓋膜、血管紋及基底膜上結(jié)構(gòu)包括毛細(xì)胞在內(nèi)亦均見表達(dá)。Smad4的表達(dá)在時間上與BMP4和Smad5有所不同，小鼠胚胎期聽泡發(fā)育及耳蝸蝸管增殖期未見陽性表達(dá)，胚胎15天開始，空間表達(dá)部位與BMP4和Smad5基本相同。Smad5、Smad4和BMP4在內(nèi)耳聽覺器官胚胎發(fā)育中后期，胚胎14天細(xì)胞開始分化以后，在時間、空間的表達(dá)基本一致。 結(jié)論：BM