血清蛋白質(zhì)指紋圖譜在甲狀腺癌診斷的臨床應(yīng)用研究.pdf

1、甲狀腺癌是常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1％，它也是內(nèi)分泌腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，占內(nèi)分泌惡性腫瘤的91.5％，近年來(lái)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。按腫瘤的病理類(lèi)型，甲狀腺癌可分為乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌、髓樣癌，其中分化型癌占80-90％，早期予以手術(shù)治療，5年生存率高達(dá)75％以上，所以甲狀腺癌早期診斷具有重要意義。目前，臨床上甲狀腺癌的診斷使用超聲、CT、MRI、核素掃描、細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查等多種手段，但我國(guó)甲狀腺癌術(shù)前誤診率仍

2、高達(dá)40-77％。長(zhǎng)期以來(lái)，醫(yī)學(xué)界一直尋求對(duì)甲狀腺癌診斷有臨床意義的標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)半乳糖凝集素，包殼素(involucrin)，甲狀腺過(guò)氧化物酶(TPO)，白細(xì)胞抗原單克隆抗體系統(tǒng)(CD)，癌胚纖維連結(jié)蛋白等，但是這些標(biāo)記物只是對(duì)某一病理類(lèi)型的甲狀腺癌敏感，限制了其在臨床的實(shí)際應(yīng)用。因此，尋找理想的生物標(biāo)記物，探索和建立一種簡(jiǎn)單、快速、敏感性高和特異性強(qiáng)的甲狀腺癌早期診斷技術(shù)已經(jīng)成了臨床醫(yī)學(xué)上的迫切需要。 蛋白組學(xué)應(yīng)用大規(guī)模蛋白質(zhì)

3、分離識(shí)別技術(shù)，立體、全面地對(duì)基因組所表達(dá)的整套蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，從細(xì)胞整體水平進(jìn)行蛋白質(zhì)屬性的研究，它的飛速發(fā)展為腫瘤的研究提供了新的思維和技術(shù)平臺(tái)。 甲狀腺癌的發(fā)生是多基因多階段多因素的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，是癌基因激活和抑癌基因失活的結(jié)果，而從功能的角度看，由于運(yùn)載信息、介導(dǎo)信息流動(dòng)的媒介是蛋白質(zhì)而不是基因，它是一種蛋白質(zhì)組性疾病，在其出現(xiàn)病理變化之前，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)在成分和數(shù)量上都會(huì)有相應(yīng)的改變，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)觀察可以篩選出疾病早

4、期的指標(biāo)和征兆。同時(shí)鑒于甲狀腺癌發(fā)生演變因素的復(fù)雜性，監(jiān)測(cè)單一或數(shù)個(gè)指標(biāo)對(duì)甲狀腺癌進(jìn)行早期診斷不可避免的存在敏感性和特異性矛盾。蛋白組學(xué)技術(shù)可以高通量的篩選腫瘤不同發(fā)展階段基因表達(dá)的各種蛋白質(zhì)，或通過(guò)正常人、相關(guān)疾病及腫瘤患者的體液在蛋白質(zhì)種類(lèi)和數(shù)量上的差異比較，從而發(fā)現(xiàn)大量有診斷價(jià)值的蛋白質(zhì)分子，確定和篩選特異的腫瘤標(biāo)志物。表面增強(qiáng)激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(Surface Enhanced Laser。Desorption/Io

5、nizayion Time of Flight-Mass Spectrometry， SELDI-TOF-MS)，是2002年開(kāi)發(fā)的新型蛋白組學(xué)技術(shù)，應(yīng)用基因芯片的設(shè)計(jì)原理，把層析、質(zhì)譜等技術(shù)合理地與蛋白芯片結(jié)合，可檢測(cè)出傳統(tǒng)方法難以鑒定的蛋白質(zhì)和多肽，具有快速、靈敏、高通量等特點(diǎn)，被用在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌等腫瘤標(biāo)記物的研究中，有重大的突破。我們利用SELDI-TOF-Ms技術(shù)檢測(cè)甲狀腺癌患者、甲狀腺良性結(jié)節(jié)患

6、者和正常人的血清蛋白質(zhì)組圖譜并結(jié)合生物信息學(xué)方法，篩選特異的標(biāo)記物，探討建立可用于甲狀腺癌早期診斷和術(shù)前定性診斷的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。 材料與方法 1．材料 1.1標(biāo)本 108例血清：甲狀腺癌40例(Ⅰ -Ⅱ期26例，Ⅲ-Ⅳ期14例)，甲狀腺良性結(jié)節(jié)36例(甲狀腺腺瘤例、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫例)，健康對(duì)照組32例。所有甲狀腺癌和甲狀腺良性結(jié)節(jié)標(biāo)本均經(jīng)2位病理學(xué)家證實(shí)。甲狀腺癌中男9例，女31例，平均年齡41歲。

7、 1．2設(shè)備表面增強(qiáng)激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SurfaceEnhanced Laser Desorption/Ionizayion Time of Flight-Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS)，(PBS Ⅱ<'+> Ciphergen Inc．美國(guó))。主要參數(shù)：收集范圍為1000-50000；優(yōu)化范圍為2000-30000。 1．3芯片 WCX<,2>為弱陽(yáng)離子結(jié)合芯片。 1．

8、4應(yīng)用軟件和標(biāo)志物評(píng)價(jià)指標(biāo)：應(yīng)用軟件：Ciphergen Software 3.1和Biomarker Wizard；支持向量機(jī)(SW)：ZUCI-ProteinChip Data Analyze System軟件包。評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)：靈敏度、特異度、Youden指數(shù)。 2．方法 2．1血清樣本處理：U9溶液處理血清，50mNaNC(pH=4)稀釋?zhuān)珺ioprocessor(可含12根芯片)結(jié)合反應(yīng)60分鐘，上述NaNC(

9、pH=4)緩沖液清洗芯片，取出芯片風(fēng)干后點(diǎn)50％飽和的SPA溶液，上機(jī)讀片。 2．2 SELDI操作： 原始數(shù)據(jù)先用Proteinchip Software 3.1做校正，總離子強(qiáng)度及分子量的均一化；再用Biomarker Wizard和ZUCI-ProtelnChip Data Analyze System軟件包中的離散小波過(guò)濾噪音，得到初步篩選結(jié)果；對(duì)初步篩選出來(lái)的質(zhì)荷比峰做個(gè)組別數(shù)據(jù)Wilconxon秩和檢驗(yàn)，按照

10、P值得大小比較每一個(gè)質(zhì)荷比峰在甲狀腺癌與對(duì)照中表達(dá)差異的顯著性程度。 2．3血清樣本分組： 組1：甲狀腺癌(40)和健康對(duì)照(32)組2：甲狀腺癌(40)和甲狀腺良性結(jié)節(jié)(36)組3：Ⅰ-Ⅱ期甲狀腺癌(26)和Ⅲ-Ⅳ期甲狀腺癌(14)。 2．4建模方法： 2．4．1初步篩選每組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的m/z。 2．4．2生物信息學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，用訓(xùn)練集建立判別模型，用測(cè)試集檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷男Я?，進(jìn)一步篩選用于建模

11、的m/z。 2．4．3評(píng)價(jià)各模型測(cè)試集的敏感性、特異性、準(zhǔn)確率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。 結(jié)果 1．甲狀腺癌組與正常人組的比較： 甲狀腺癌組與正常人組質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)初步篩選得到347個(gè)M/Z峰，其相對(duì)強(qiáng)度做Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到46個(gè)P值小于0.01的M/Z峰，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的youden指數(shù)最高的組合模型，得到3個(gè)m/z位于6651、6452、6984的

12、標(biāo)志物，在甲狀腺癌低表達(dá)，在正常人高表達(dá)。聯(lián)合3個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值，留一法交叉檢測(cè)，在測(cè)試集上甲狀腺癌篩查模型的特異性為80％，敏感度為87.5％。 對(duì)15例未知血清標(biāo)本應(yīng)用已確定的方法測(cè)定血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜，將每例血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入已建立的支持向量機(jī)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，8例甲狀腺癌中有8例，7例正常對(duì)照中有6例被正確預(yù)測(cè)；得出該模型的特異性為86％，敏感性為100％。 2．甲狀腺癌組與甲狀腺良性結(jié)節(jié)組的比較： 甲

13、狀腺癌組和甲狀腺良性結(jié)節(jié)組初步篩選出347個(gè)M/Z峰，經(jīng)Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到6個(gè)P值小于0.01的M/Z峰，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的youden指數(shù)最高的組合模型，得到5個(gè)標(biāo)記蛋白，3個(gè)m/z位3400、3690、2902．6的標(biāo)記物，在甲狀腺癌高表達(dá)，在甲狀腺良性結(jié)節(jié)低表達(dá)；而2個(gè)m/z位于3937、2687.8的標(biāo)記物與之相反。聯(lián)合5個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值，用留-法分類(lèi)器評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)效

14、果，在測(cè)試集上甲狀腺癌定性診斷模型的特異性87％，敏感性81％。 該模型進(jìn)一步用14例血清標(biāo)本盲法測(cè)試，8例甲狀腺癌中有7例，6例甲狀腺良性結(jié)節(jié)中有5例被正確預(yù)測(cè)，得出該模型的特異性為83％，敏感性為88％。 3．Ⅰ-Ⅱ期甲狀腺癌組和Ⅲ-Ⅳ期甲狀腺癌組的比較 Ⅰ-Ⅱ期甲狀腺癌組和Ⅲ-Ⅳ期甲狀腺癌組初步篩選出206個(gè)M/Z峰，利用判別分析處理數(shù)據(jù)，得到4個(gè)M/Z為2285、2182、2068、2196的標(biāo)記物，均在

15、Ⅰ-Ⅱ期甲狀腺癌高表達(dá)，在Ⅲ-Ⅳ期甲狀腺癌低表達(dá)。以這4個(gè)M/Z為峰值的組合，交叉檢驗(yàn)Ⅰ -Ⅱ期甲狀腺癌檢出的準(zhǔn)確率77％，Ⅲ-Ⅳ期甲狀腺癌檢出的準(zhǔn)確率86％，總的準(zhǔn)確率為80％。 結(jié)論 不同的樣本需要不同的蛋白芯片，必須根據(jù)標(biāo)本的特征選用。本試驗(yàn)選用的WCX2蛋白芯片在可選用的數(shù)種芯片中所結(jié)合的蛋白量最多，根據(jù)其建立的實(shí)驗(yàn)方法具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。在信息處理中，本試驗(yàn)根據(jù)樣本量較小，而分布較整齊的特點(diǎn)，選用了在中小

16、樣本模型中推廣性、模型選擇、過(guò)擬和、緯數(shù)災(zāi)難等問(wèn)題得到很好解決的SW。 4．1運(yùn)用SVM分析方法，聯(lián)合M/Z在6651、6452、6984的3個(gè)峰值在區(qū)分甲狀腺癌與正常人群對(duì)照判別模型中特異性86％，敏感性100％。對(duì)從健康人群中篩檢甲狀腺癌患者具有很好的應(yīng)用價(jià)值。 4．2運(yùn)用SVM分析方法，聯(lián)合M/Z在3400、3690、2902.6、3937、2687.8的5個(gè)峰值在區(qū)分甲狀腺癌與甲狀腺良性結(jié)節(jié)的判別模型中特異性為8

17、3％，敏感性為88％。對(duì)鑒別甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)，甲狀腺癌術(shù)前定性判別具有很好的應(yīng)用價(jià)值。 4．3運(yùn)用判別分析方法，聯(lián)合M/Z在2285、2182、2068、2196的4個(gè)峰值對(duì)Ⅰ-Ⅱ期甲狀腺癌檢出的準(zhǔn)確率77％，Ⅲ-Ⅳ期甲狀腺癌檢出的準(zhǔn)確率86％。提示該判別模型可在術(shù)前判斷甲狀腺癌臨床分期，對(duì)術(shù)前分期的判斷有一定的應(yīng)用價(jià)值。 4．4運(yùn)用SELDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)方法尋找甲狀腺癌篩查和定性診斷的血清蛋白標(biāo)記物