氧干預(yù)長(zhǎng)爪沙鼠全腦缺血再灌注氧化應(yīng)激與能量代謝的研究.pdf

1、半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，心肺復(fù)蘇后的低生存率狀況并沒(méi)有得到根本性的改觀，使得人們開始把目光從心肺復(fù)蘇術(shù)技術(shù)本身轉(zhuǎn)向如何更為科學(xué)有效的進(jìn)行復(fù)蘇后治療[1]?；謴?fù)缺血組織的血供可以阻止細(xì)胞損害的加重，但非常遺憾的是，它又不可避免地引發(fā)了一系列復(fù)雜而嚴(yán)重的缺血再灌注損害(ischemia-reperfusion injury，IRI)，并成為復(fù)蘇后綜合征的直接原因。腦在整個(gè)心肺復(fù)蘇的病理生理過(guò)程中，無(wú)論是缺血階段還是再灌注階段都最為敏感和易損。因而腦復(fù)

2、蘇成敗就成為了救治復(fù)蘇后死亡和功能障礙的關(guān)鍵。近年來(lái)，醫(yī)學(xué)工作者開始關(guān)注最為常規(guī)的復(fù)蘇治療方式-氧療，探索不同氧治療策略對(duì)心肺復(fù)蘇腦功能保護(hù)的影響。
　　心肺復(fù)蘇后重新恢復(fù)氧輸送對(duì)通過(guò)氧化磷酸化途徑而恢復(fù)能量物質(zhì)(adenosine triphosphate，ATP)的合成至關(guān)重要。然而，大量研究表明過(guò)量過(guò)快的恢復(fù)供氧卻加重了再灌注后的組織細(xì)胞損傷，究其原因可能為再灌注的早期階段的氧自由基爆發(fā)性生成。理論上，再灌注早期階段高氧分壓

3、環(huán)境可能會(huì)增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，從而加重氧化應(yīng)激損傷，與氧相關(guān)的再灌注氧化應(yīng)激損傷也就不可避免的發(fā)生了。氧化應(yīng)激源于促氧化作用與抗氧化機(jī)制的失平衡和由此過(guò)多產(chǎn)生的ROS。腦對(duì)于ROS具有極高的敏感性，原因在于其特殊的生化和生理特性:它含有大量不飽和脂肪酸，可直接與自由基發(fā)生作用;腦內(nèi)自由基防御系統(tǒng)不完善，參與清除自由基的酶類或其它物質(zhì)如超氧化物歧化酶(superoxide dismu

4、tase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)和維生素E等含量較少等，當(dāng)某些因素誘發(fā)氧自由基大量產(chǎn)生時(shí)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)細(xì)胞自身的抗氧化能力，就可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大分子損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞受損、死亡或凋亡。既然氧自由基在心肺復(fù)蘇過(guò)程中存在的負(fù)面作用，以及理論上在復(fù)蘇再灌注階段提高氧輸送可能增加氧自由基的產(chǎn)生，那么人們開始對(duì)氧在心肺復(fù)蘇過(guò)程中的地位加以反思，對(duì)以往心肺復(fù)蘇后氧治療的隨意性提出質(zhì)疑。

5、　　目前國(guó)際上針對(duì)心肺復(fù)蘇尚沒(méi)有清晰明確的氧治療策略，為數(shù)不多的研究成果并沒(méi)有給出足夠的證據(jù)以明確心肺復(fù)蘇預(yù)后情況與吸入何種濃度氧之間有必然的聯(lián)系，更缺少大樣本的臨床研究加以支持。然而高的吸入氧濃度并不一定意味著高的氧輸送，在組織缺血再灌注這一病理生理過(guò)程中，低灌注甚至無(wú)灌注一直沒(méi)有有效的治療手段加以克服，當(dāng)處于低灌注狀況下，提高氧輸送的唯一辦法就只能是提高循環(huán)體液的氧分壓水平，即提高吸入氧濃度來(lái)改善氧合狀況。在這種情況下，如何來(lái)平衡提

6、高供氧和減少再灌注氧化損害之間的矛盾關(guān)系，將成為今后腦復(fù)蘇領(lǐng)域亟待解決的重要課題。
　　本課題采用阻斷雄性長(zhǎng)爪沙鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈(bilateral carotid artery occlusion，BCAO)再開放法，建立急性全腦缺血再灌注動(dòng)物模型，模擬腦復(fù)蘇過(guò)程中海馬CA1區(qū)羥自由基水平的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，探討不同濃度、不同時(shí)相的氧療干預(yù)對(duì)羥自由基生成以及氧化應(yīng)激的影響，并進(jìn)一步研究缺血再灌注損傷對(duì)中樞神經(jīng)細(xì)胞能量代謝影響及機(jī)制，探

7、索更科學(xué)合理、切實(shí)可行的腦復(fù)蘇氧治療策略。
　　實(shí)驗(yàn)材料及方法:
　　一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　選取健康雄性長(zhǎng)爪沙鼠，體重70-95g，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔度為普通級(jí)，常規(guī)飼料，自由飲水，溫度22±1℃，濕度50％左右，明/暗周期為12h，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理學(xué)編號(hào):2013PS139K
　　二、建立腦立體定位微透析及全腦缺血再灌注動(dòng)物模型
　　長(zhǎng)爪沙鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境5-7天后

8、，10％水合氯醛(按體重0.30ml/100g)腹腔注射麻醉，固定于腦立體定位儀，行頭部皮膚矢狀切口，暴露右側(cè)半球顱骨，參考立體定位解剖圖譜及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果定位右側(cè)海馬CA1區(qū)坐標(biāo)(前囟后2mm，旁開2mm，硬腦膜下2.5mm)，鉆取直徑2mm骨窗，垂直插入自制微透析導(dǎo)軌，骨水泥并覆蓋顱骨創(chuàng)面。所有沙鼠術(shù)后均單獨(dú)飼養(yǎng)并恢復(fù)1天。
　　微透析導(dǎo)軌植入術(shù)后24小時(shí)，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)任何行為、功能異常。常規(guī)麻醉鼠板固定，頸前正中切口，于雙側(cè)胸

9、鎖乳突肌及氣管旁間隙暴露頸動(dòng)脈鞘，仔細(xì)分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈及迷走神經(jīng)，無(wú)創(chuàng)顯微動(dòng)脈夾阻斷并計(jì)時(shí)（10分鐘）后開放阻斷，以動(dòng)脈顏色變紅及血流搏動(dòng)證實(shí)再灌注成功，建立全腦缺血再灌注模型。
　　阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈前30分鐘，給予沙鼠經(jīng)口氣管插管及機(jī)械通氣，設(shè)定定容通氣模式，VT2.5ml，f70次/分，I∶E=1∶1，F(xiàn)1O2:30％,再灌注建立后按簡(jiǎn)單隨機(jī)法分組并調(diào)整F1O2:常壓常氧治療組(NO，F(xiàn)1O2:30％2小時(shí))、常壓高氧治療組(

10、HO，F(xiàn)1O2:100％2小時(shí))及延遲常壓高氧治療組(DHO，F(xiàn)1O2:30％1h then100％1h total2 h)以及正常對(duì)照組(Sham-Control)，共4組。
　　股動(dòng)脈插管，監(jiān)測(cè)血壓（平穩(wěn)無(wú)顯著波動(dòng)）及血?dú)獠蓸印?br>　　調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)維持血?dú)庵笜?biāo):PaO260-70mmHg（常壓常氧）或PaO2＞300mmHg（常壓高氧），PaCO235-50 mmHg，PH7.35-7.45。
　　直腸溫度監(jiān)測(cè):烤

11、燈維持體溫37±0.5℃
　　三、主要實(shí)驗(yàn)方法
　　1、采用活體腦立體定位微透析對(duì)海馬CA1區(qū)連續(xù)采樣，高效液相色譜-電化學(xué)法(high performance liquid chromatography-electrochemical detect,HPLC-ECD)定量檢測(cè)微透析液中二羥基苯甲酸(dihydroxybenzoic acid，DHBA)。
　　2、采用Western blot雜交技術(shù)檢測(cè)海馬組織低氧誘

12、導(dǎo)因子(hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1α)、丙酮酸脫氫酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase1，PDK1)表達(dá)
　　3、采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)海馬組織中HIF-1αmRNA、PDK1mRNA的表達(dá)。
　　4、采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)腦內(nèi)HIF-1α、PDK1的表達(dá)與定位。
　　5、采用ELISA試劑盒檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛（

13、malondialdehyde，MDA）、丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)活性及磷酸化丙酮酸脫氫酶(phosphorylated PDH E1α subunit ser232，PDHA1-S232)含量。
　　6、采用尼氏染色及透射電鏡技術(shù)對(duì)進(jìn)行神經(jīng)元形態(tài)學(xué)及亞細(xì)胞器檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1、全腦缺血再灌注及腦立體定位微透析長(zhǎng)爪沙鼠模型建立:全腦缺血時(shí)間，即BCAO時(shí)間選定為10分

14、鐘，滿足對(duì)組織內(nèi)羥自由基捕獲及檢測(cè)的穩(wěn)定性，同時(shí)降低造模及術(shù)后觀察期間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率;微透析探針準(zhǔn)確定位于沙鼠右側(cè)半球海馬CA1區(qū);在設(shè)定色譜條件下DHBA在0.125-100 ng/ml之間存在良好峰高線性關(guān)系，檢測(cè)方法敏感性高、重復(fù)性好，室溫條件下5次進(jìn)樣10 ng/ml2.3-DHBA及2.5-DHBA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為6.5％和6.1％，而10次進(jìn)樣50 ng/ml2.3-DFIBA及2.5-DHB

15、A標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)得的RSD分別為2.9％和3.3％，微透析探針在穩(wěn)定1小時(shí)條件下，對(duì)2.3-DHBA及2.5-DHBA標(biāo)準(zhǔn)品液的回收率(n=5)分別為（69.1±4.6）％和（74.3±3.2）％，最終可以達(dá)到對(duì)連續(xù)微透析液采樣監(jiān)測(cè)目標(biāo)物濃度變化的技術(shù)要求。
　　2、全腦缺血再灌注這一病理生理過(guò)程中，海馬CA1區(qū)存在再灌注早期ROS，特別是·HO(2.3-DHBA、2.5-DHBA)的爆發(fā)性生成，DHBA的濃度具有動(dòng)態(tài)演變及時(shí)效性

16、特點(diǎn)，供氧濃度變化對(duì)DHBA有直接影響:①全腦缺血階段，微透析液中2.3-DHBA及2.5-DHBA濃度保持穩(wěn)定，較對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。②再灌注早期階段，NO及HO組微透析液中2.3-DHBA及2.5-DHBA濃度均呈現(xiàn)爆發(fā)性升高，達(dá)峰值后逐漸降低回正常水平，整個(gè)動(dòng)態(tài)演變過(guò)程于再灌注2小時(shí)內(nèi)完成，其中NO組中2.3-DHBA濃度較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)為:10-40min共4點(diǎn)，2.5-DHBA濃度較對(duì)

17、照組明顯升高(P＜0.05)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)為:10-50min共5點(diǎn);HO組中2.3-DHBA濃度較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)為:10-60min共6點(diǎn)，2.5-DHBA濃度較對(duì)照組明顯升高(p＜0.05)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)為:10-80min共8點(diǎn)。此外，HO組2.3-DHBA濃度較NO組明顯升高(P＜0.05)時(shí)間節(jié)點(diǎn)位于10-60min共6點(diǎn)，而2.5-DHBA濃度較NO組明顯升高(P＜0.05)時(shí)間節(jié)點(diǎn)位于20-80min共7

18、點(diǎn)。⑧以NO組DHBAs動(dòng)態(tài)變化規(guī)律為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的DHO組（F1O2:30％1小時(shí)再100％1小時(shí)，總計(jì)2小時(shí)），在10-120min的各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)監(jiān)測(cè)微透析液中2.3-DHBA及2.5-DHBA濃度變化較NO組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3、全腦缺血再灌注的早期階段（再灌注2小時(shí)），其海馬、皮質(zhì)組織中抗氧化酶SOD、CAT活性明顯降低，而脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA則顯著升高，同時(shí)氧暴露濃度變化對(duì)MDA有直接影響:①NO、HO及

19、DHO組SOD、CAT活性相比對(duì)照組均有明顯降低(P＜0.05)，但各組間比較無(wú)明顯差異(P＞0.05);同時(shí)NO、HO及DHO組MDA較對(duì)照組顯著升高(P＜0.05);同時(shí)NO、DHO組間比較MDA濃度無(wú)差異(P＜0.05)，但二者和HO組比較，HO組中海馬、皮質(zhì)組織MDA濃度較NO、DHO兩組均有顯著增加(P＜0.05)。
　　4、PDH活性檢測(cè):再灌注2小時(shí)NO、HO、DHO組海馬、皮質(zhì)組織內(nèi)PDH活性較對(duì)照組均有降低，其中

20、NO及HO兩組與對(duì)照組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而DHO組與對(duì)照組比較減低不明顯（P＞0.05），DHO組PDH活性較NO、HO組增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5、PDHA1-S232磷酸化檢測(cè):再灌注2小時(shí)各組海馬、皮質(zhì)組織內(nèi)磷酸化PDHAl-S232程度較對(duì)照組均有增高，其中NO組較HO、DHO組的磷酸化水平增高顯著(P＜0.05)。
　　6、全腦缺血再灌注導(dǎo)致海馬及皮質(zhì)內(nèi)HIF-1α、PDK1/PDK1

21、 mRNA表達(dá)增高，而再灌注階段高濃度氧暴露能夠抑制HIF-1α、PDK1/PDK1 mRNA的高表達(dá):再灌注2小時(shí)，NO組HIF-1α、PDK1/PDK1 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯增高（P＜0.05）;HO組HIF-1α、PDK1/PDK1 mRNA表達(dá)較對(duì)照組增高不明顯(P＞0.05); DHO組HIF-1αt、PDK1/PDK1 mRNA表達(dá)同樣與對(duì)照組比較增高不顯著(P＞0.05);NO組與HO及DHO組比較HIF-1α、PDK

22、1/PDK1 mRNA表達(dá)增高(P＜0.05);四組HIF-1α mRNA表達(dá)均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　7、形態(tài)學(xué)檢測(cè):再灌注7天透射電鏡下DHO組海馬CA1區(qū)也有更好的亞細(xì)胞器（細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）完整性;而尼氏染色DHO組也較NO、HO組海馬CA1區(qū)也有更好的神經(jīng)元排列及尼氏小體表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1、全腦缺血再灌注早期海馬CA1區(qū)發(fā)生爆發(fā)性的羥自由基(·HO)生成，其峰值出現(xiàn)在再灌注的10-20

23、min，而顯著升高的時(shí)間段為50min以內(nèi);常壓高濃度氧暴露（純氧）可以顯著地增加·HO生成的強(qiáng)度，表現(xiàn)為其峰值明顯增高且持續(xù)時(shí)間顯著延長(zhǎng)達(dá)到70min;當(dāng)給予延遲的常壓高濃度供氧（再灌注60min以后給予純氧暴露），其對(duì)再灌注·HO的生成較常壓常氧干預(yù)無(wú)明顯差異。得出結(jié)論:全腦缺血再灌注后ROS的爆發(fā)性生成是一對(duì)時(shí)間及氧暴露濃度雙重依賴的病理生理學(xué)過(guò)程。
　　2、全腦缺血再灌注階段不同的氧暴露方式均對(duì)腦組織抗氧化系統(tǒng)(SOD、C

24、AT)造成顯著抑制;同時(shí)其脂質(zhì)過(guò)氧化損傷也有顯著增強(qiáng)，這一特征在給予高濃度氧暴露時(shí)更為明顯，但延遲常壓純氧暴露與常壓常氧比較并未見有額外加重的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。
　　3、延遲常壓高高氧干預(yù)可以改善再灌注階段PDH的活性，有利于恢復(fù)和促進(jìn)腦組織的有氧能量代謝，其機(jī)制可能但不完全為:①不進(jìn)一步加重PDH的過(guò)氧化損傷;②改善再灌注階段組織細(xì)胞內(nèi)乏氧環(huán)境，通過(guò)增加HIF-1α胞漿內(nèi)分解，進(jìn)而降低其下游PDK1的表達(dá)，導(dǎo)致PDHA1-S232