慢性睡眠剝奪對(duì)大鼠前額皮質(zhì)多巴胺D1受體信號(hào)通路的影響.pdf

1、睡眠剝奪(SD)是一種普遍存在的社會(huì)現(xiàn)象，長(zhǎng)時(shí)間SD將會(huì)嚴(yán)重影響機(jī)體的行為、學(xué)習(xí)和工作。與短期的急性睡眠剝奪(ASD)相比，長(zhǎng)期的慢性睡眠剝奪(CSD)對(duì)高級(jí)神經(jīng)功能（學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知和決策等）和工作效率的影響更加嚴(yán)重。前人研究表明PFC在CSD導(dǎo)致的神經(jīng)行為學(xué)改變中發(fā)揮著重要作用，在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)CSD可導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和自主活動(dòng)能力的降低，同時(shí)PFC內(nèi)多巴胺(DA)含量下降，多巴胺D1受體(D1R) mRNA和蛋白表達(dá)水平降

2、低，PFC深層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)受損，而D1R激動(dòng)劑SKF38393干預(yù)后，可改善這一現(xiàn)象。這些實(shí)驗(yàn)表明PFC內(nèi)DA及其D1R可能參與調(diào)節(jié)了CSD導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力以及探索能力下降的過(guò)程。
　　 D1R作為一種G蛋白偶聯(lián)受體，可通過(guò)AC-cAMP-PKA通路、磷酸肌醇通路和有絲分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路調(diào)控核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(CREB)的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的功能。而在CSD導(dǎo)致PFC功能障礙以及激動(dòng)D

3、1R改善PFC的過(guò)程中，D1R主要通過(guò)哪條信號(hào)通路調(diào)節(jié)神經(jīng)功能？其中關(guān)鍵信號(hào)分子是什么？是否還存在其他調(diào)節(jié)途徑？均有待于進(jìn)一步研究探討。因此，我們通過(guò)基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)了大鼠PFC內(nèi)全部基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，分析尋找CSD導(dǎo)致PFC結(jié)構(gòu)和功能改變的新的信號(hào)通路及其關(guān)鍵信號(hào)分子。通過(guò)RT-PCR和Western blot技術(shù)分別驗(yàn)證了D1R信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)分子的基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平。闡明D1R調(diào)控CSD導(dǎo)致PFC結(jié)構(gòu)和功能受損過(guò)程的

4、主要通路和信號(hào)分子。
　　 第一部分慢性睡眠剝奪對(duì)前額皮質(zhì)基因表達(dá)譜的影響
　　 目的:觀(guān)察CSD對(duì)PFC內(nèi)各個(gè)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的影響，探尋調(diào)節(jié)CSD導(dǎo)致PFC結(jié)構(gòu)和功能改變的關(guān)鍵信號(hào)分子及其相關(guān)的功能途徑。
　　 材料與方法:選用成年健康雄性Sprague Dawle大鼠60只，經(jīng)體重、Morris水迷宮訓(xùn)練和小平臺(tái)站立訓(xùn)練篩選出45只，并隨機(jī)分為三組:大平臺(tái)環(huán)境處理對(duì)照(TC)組，慢性睡眠剝奪(CSD)組和激

5、動(dòng)劑干預(yù)(SKF)組，每組樣本量為15。TC組大鼠放入水環(huán)境相同的大平臺(tái)對(duì)照箱內(nèi)保證其正常睡眠，其他兩組采用改良多平臺(tái)水環(huán)境剝奪法(MMPM)對(duì)大鼠進(jìn)行每天18h(16:00-10:00)快速眼動(dòng)睡眠（REM）剝奪，持續(xù)21d。從剝奪第15d開(kāi)始，每天上午(10:00-11:00)，TC組與CSD組每只大鼠腹腔注射1mL PBS對(duì)照溶液，SKF組每只大鼠腹腔注射1mL多巴胺D1R特異激動(dòng)劑SKF38393（1mg/kg），連續(xù)給藥7d。

6、睡眠剝奪結(jié)束后，快速取腦，冰上分離雙側(cè)PFC，置于-80℃凍存?zhèn)溆?。每組隨機(jī)選取4個(gè)樣本（其中3個(gè)用于檢測(cè)，1個(gè)備用），通過(guò)表達(dá)譜基因芯片檢測(cè)PFC內(nèi)各個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。然后挑選19個(gè)基因，取用于芯片檢測(cè)的3個(gè)樣本的剩余RNA，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(RT-PCR/qPCR)驗(yàn)證芯片檢測(cè)質(zhì)量。
　　 結(jié)果:芯片驗(yàn)證擬合度為r2=0.85，芯片檢測(cè)合格。篩選差異基因(p＜0.05且FC≥1.5)，各組表達(dá)情況為:
　　

7、 與TC組相比，CSD組存在208個(gè)差異表達(dá)基因，其中88個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，120基因表達(dá)上調(diào);對(duì)兩組差異基因進(jìn)行GO基因功能分類(lèi)，富集度檢驗(yàn)p＜0.05的功能分類(lèi)情況為:三級(jí)功能分類(lèi)有29個(gè)，二級(jí)功能分類(lèi)有5個(gè);兩組差異基因所關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路中，富集度檢驗(yàn)p＜0.05的信號(hào)通路有22個(gè)，其中主要包括MAPK、各種代謝調(diào)節(jié)、晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等通路。
　　 與CSD組相比，SKF組存在115個(gè)差異基因，其中57個(gè)表達(dá)下調(diào)，58個(gè)

8、表達(dá)上調(diào)。與TC組相比，SKF組存在126個(gè)差異基因，其中59個(gè)表達(dá)水平下降，67個(gè)表達(dá)水平升高。
　　 此外，與CSD組相比，TC組與SKF組具有Hspb1，S100a9，Homer1等14個(gè)相同表達(dá)趨勢(shì)的差異基因。與TC組相比，CSD組與SKF組具有Per2、Chm、Cm13等15個(gè)相同表達(dá)趨勢(shì)的差異基因。
　　 討論:CSD組與TC組的差異基因最多，達(dá)到208個(gè)，CSD損傷PFC結(jié)構(gòu)導(dǎo)致高級(jí)神經(jīng)功能障礙的過(guò)程，可能

9、是通過(guò)影響這些基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這些差異基因可能與發(fā)育、細(xì)胞殺傷、免疫系統(tǒng)和各種代謝調(diào)節(jié)等功能或途徑的調(diào)控有關(guān)。值得注意的是，D1R激動(dòng)劑SKF38393的干預(yù)，使Hspb1，S100a9，Homer1等14個(gè)受CSD影響的基因恢復(fù)到了正常水平，這說(shuō)明在激動(dòng)D1R改善CSD對(duì)PFC結(jié)構(gòu)和功能損傷的過(guò)程中，可能是通過(guò)這些基因發(fā)揮了主要的調(diào)節(jié)作用。這些基因多與鈣離子通路、MAPK通路、應(yīng)激以及凋亡等功能途徑有關(guān)，因而，除了D1R介導(dǎo)的信號(hào)

10、通路外，SKF38393可能通過(guò)這些基因及其相關(guān)途徑來(lái)影響CSD對(duì)PFC結(jié)構(gòu)和功能改變。
　　 此外，激動(dòng)D1R并未完全的反轉(zhuǎn)CSD對(duì)PFC內(nèi)基因表達(dá)的影響作用，比如Per2、Chm、Cm13等15個(gè)基因的表達(dá)并沒(méi)有受到SKF38393的影響，所以還可能存在多巴胺受體系統(tǒng)以外的其他損傷機(jī)制。
　　 第二部分慢性睡眠剝奪對(duì)前額皮質(zhì)內(nèi)D1R信號(hào)通路的影響
　　 目的:研究CSD對(duì)PFC內(nèi)D1R所介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響，

11、闡明D1R調(diào)控CSD導(dǎo)致PFC結(jié)構(gòu)功能受損過(guò)程的主要途徑和信號(hào)分子。
　　 材料與方法:分析芯片結(jié)果中多巴胺D1R所介導(dǎo)通路內(nèi)的已知信號(hào)因子基因的表達(dá)水平變化;取每組6個(gè)樣本，通過(guò)RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證與D1R信號(hào)通路相關(guān)的17個(gè)信號(hào)分子的基因表達(dá)水平。取每組4個(gè)樣本，通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)與D1R信號(hào)通路相關(guān)的7個(gè)調(diào)節(jié)分子的蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平。
　　 結(jié)果:芯片結(jié)果指出:CSD導(dǎo)致多巴胺D1R所介導(dǎo)通

12、路內(nèi)的已知信號(hào)分子中有15個(gè)基因發(fā)生改變（p＜0.05或FC≥1.5），其中Camk4和Camk1g差異明顯(p＜0.05且FC≥1.5)，與CSD組相比，SKF組中Rap1a、Rasgrf1和Creb三個(gè)基因恢復(fù)到正常水平(FC≥1.5)。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示:與TC組相比，CSD組內(nèi)Plcb1，Camk4，Camk1g，Rap1a，Rap1b和Erk1的表達(dá)顯著下降，而與CSD組相比，SKF組內(nèi)Plcb1，Camk4

13、，Drd1a，Prkaca，Darpp32，Pkcγ，Rap1a和Rap1b的表達(dá)顯著增高。
　　 Western blot結(jié)果顯示:在總蛋白水平上， CSD組內(nèi)PLCβ和NMDAR1表達(dá)顯著性降低，而在SKF組中PLCβ，CaMKⅣ和CREB的表達(dá)顯著升高;在磷酸化水平上，CSD組PLCγ，IP3R1，CaMKⅣ，NMDAR1和CREB的表達(dá)顯著性降低，而SKF組的7個(gè)被檢測(cè)分子的表達(dá)均顯著性升高。
　　 討論:本教研

14、室前期研究表明CSD導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力下降與DA及其D1R調(diào)節(jié)受阻致使PFC神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能損害有關(guān)。而D1R可通過(guò)AC-cAMP-PKA，MAPK和磷酸肌醇三條信號(hào)通路調(diào)節(jié)核內(nèi)CREB等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。
　　 由芯片和PCR對(duì)基因的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在基因的轉(zhuǎn)錄水平上，CSD沒(méi)有顯著改變PKA通路中關(guān)鍵分子的基因表達(dá)，而芯片差異基因的富集檢驗(yàn)推測(cè)出CSD對(duì)大鼠PFC內(nèi)MAPK通路的調(diào)節(jié)產(chǎn)生重要影響，經(jīng)檢驗(yàn)推測(cè)MAPK通路中由小G蛋白R(shí)

15、ap和Ras調(diào)節(jié)的ERK1/2通路可能在CSD導(dǎo)致PFC改變和之后恢復(fù)的過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。研究還發(fā)現(xiàn)CSD顯著改變了磷酸肌醇通路中磷脂酶C(PLC)，肌醇三磷酸受體(IP3R)和鈣/鈣調(diào)素依賴(lài)的蛋白激酶(CaMKs)等分子的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白磷酸化水平，這些分子的基因與胞內(nèi)鈣離子水平的調(diào)節(jié)有關(guān)，而D1R激動(dòng)劑SKF38393的干預(yù)可反轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。綜上所述，可推測(cè)在CSD損害PFC組織結(jié)構(gòu)和功能的過(guò)程中，PFC內(nèi)由D1R介導(dǎo)的MAPK通