氧腈酶催化合成手性藥物中間體的研究.pdf

1、研究目的：手性α-氰醇作為手性源可以衍生得到手性α-羥基酮、α-羥基酸酯、β-羥基胺和α-氨基腈等諸多重要的藥用、農(nóng)用和精細化工產(chǎn)品的手性中間體。以氧腈酶為生物催化劑立體選擇性的催化合成手性α-氰醇，在形成新的C-C鍵的同時，產(chǎn)物的分子結構中也被引入了手性。本論文以多種來源的氧腈酶為生物催化劑，催化生成在藥物合成中具有重要應用價值的手性α-氰醇的藥用中間體；通過固定化技術對不同選擇性和不同結構的氧腈酶進行固定后使用，為氧腈酶的工業(yè)化應用

2、打下基礎；探索新的氧腈酶源，尤其是從微生物中篩選在植物中含量相對較少的S-選擇性的氧腈酶，擴大S-型氧腈酶的來源，以期在合成手性藥物中間體時，具有廉價易得的S-型氧腈酶可利用。 研究方法： 1.本研究選取的底物分別為：苯乙醛、5-苯并噻吩甲醛、3,4-亞甲二氧基苯甲醛、3,4-亞甲二氧基苯乙醛和3,4-亞甲二氧基苯丙酮。通過化學法合成出相應的五種外消旋乙酰化α-氰醇和一種由3,4-亞甲二氧基苯甲醛與硝基甲烷反應生成的相應

3、外消旋乙酰化β-硝基醇。以上述產(chǎn)物為標準品探索合適的色譜條件，為準確分析生物轉化產(chǎn)物的ee值奠定基礎。 2.在含有檸檬酸緩沖液的IPE反應體系中，以丙酮氰醇為HCN源，使用苦杏仁(PaHNL)、蘋果、櫻桃、枇杷和木瓜(CsHNL)五種R-選擇性的氧腈酶和橡膠(HbHNL)、木薯(MeHNL)兩種S-選擇性的氧腈酶為生物催化劑，分別催化五種底物的手性羥腈化反應。以收率和ee值的高低為指標，比較具有相同選擇性的氧腈酶轉化以上底物的能

4、力。 3.以HbHNL為催化劑，催化3,4-亞甲二氧基苯甲醛與硝基甲烷的縮合反應，分別考察有機溶劑的種類、緩沖溶液的濃度、pH值、緩沖溶液的百分含量和硝基甲烷的濃度對生物轉化的影響，確定該類生物轉化反應的最佳反應條件。 4.分別使用多醛基葡聚糖和EupergitC為固定化載體，與蘋果氧腈酶共價結合后，得到相應的固定化酶。進行三因素七水平的均勻設計實驗，研究不同條件下生成的多醛基葡聚糖對固定化酶活性的影響。探討Euperg

5、itC與蘋果氧腈酶結合時，緩沖溶液的pH值、濃度和EupergitC用量對固定化酶活性的影響。分別檢測兩種方法對蘋果氧腈酶固定化的牢固程度。使用5-苯并噻吩甲醛為底物，以收率和ee值的大小為指標，對比固定化酶與游離酶在雙相和微水相反應體系中的催化結果。探討底物分別被固定化蘋果氧腈酶循環(huán)催化的情況。 5.使用磁性微球?qū)bHNL進行固定化，檢測HbHNL被固定化的牢固程度及放置時間對固定化酶活性的影響，探討固定化酶被循環(huán)使用的次數(shù)

6、，以3,4-亞甲二氧基苯甲醛為底物，以收率和ee值的大小為指標，對比固定化酶與游離酶在雙相和微水相反應體系中的催化結果，探討底物分別被磁性微球固定化HbHNL循環(huán)催化的情況。 6.以外消旋2-(苯并噻吩-5-基)-2-羥基乙腈為HCN的供體，以3,4-亞甲二氧基苯甲醛為底物，在磁性微球固定化HbHNL催化下，嘗試一次生物轉化得到兩種具有重要用途的手性α-氰醇。 7.從反應體系pH值、酶制劑的種類和用量、丙酮氰醇的用量等方

7、面探討3,4-亞甲二氧基苯丙酮被手性羥腈化時ee值低下的原因。 8.以苯乙酮為底物，優(yōu)化來源于木瓜氧腈酶(以前未見報道)的催化反應條件，探討其催化一系列甲基酮底物手性羥腈化的能力。嘗試使用多種植物組織粗粉為催化劑，以苯甲醛為轉化底物，以期尋找到新的植物來源的氧腈酶。以多份土壤為待篩樣品，以扁桃腈為唯一碳源，從中篩選僅產(chǎn)S-型氧腈酶的微生物。 結果： 1.以ChiralcelOB-H(4.6×250mm，5μm)為

8、手性固定相，以不同體積百分比的正己烷和異丙醇溶液為流動相，對五種外消旋乙?；?氰醇和一種乙?；?硝基醇進行了較好的分離。 2.蘋果氧腈酶催化五種底物生物轉化的收率介于24-91％之間，催化生成R-型產(chǎn)物的ee值介于41-97％之間。HbHNL催化五種底物生物轉化的收率介于35-85％之間，催化生成S-型產(chǎn)物的ee值介于29-98％之間。 3.在含檸檬酸緩沖液(40％v/v，0.2M，pH7.5)的MTBE溶液(10m

9、L)中，當加入的HbHNL量為200μL硝基甲烷與3,4-亞甲二氧基苯甲醛初始濃度分別為2.4M和0.3M時，20-25℃反應24h后生物轉化的收率為71％，ee值為83％。 4.使用100kDa的葡聚糖、葡聚糖和高碘酸鈉的用量分別為1.2g和1.8g、反應130min時制得的多醛基葡聚糖與1mL蘋果氧腈酶粗提液反應，交聯(lián)后的固定化酶與游離酶相比保留了53％的酶活。循環(huán)催化苯乙醛羥腈化反應10次也未見明顯的酶活喪失。循環(huán)催化5-

10、苯并噻吩甲醛、3,4-亞甲二氧基苯甲醛和3,4-亞甲二氧基苯乙醛的手性羥腈化反應8次時，分別從不同的使用輪次開始多醛基葡聚糖固定化酶的催化能力開始有了顯著降低。在1.2M，pH5.0磷酸二氫鈉緩沖溶液中，以350mg的EupergitC與200μL蘋果氧腈酶粗提液反應，制得的EupergitC固定化酶與游離酶相比保留了69％的酶活。循環(huán)催化3,4-亞甲二氧基苯乙醛的手性羥腈化反應8次以上時，產(chǎn)物的ee值下降明顯。循環(huán)催化苯乙醛、5-苯并

11、噻吩甲醛和3,4-亞甲二氧基苯甲醛手性羥腈化反應10次以上未見明顯的酶活降低。以上兩種固定化蘋果氧腈酶在0℃微水相體系中，表現(xiàn)出了比游離酶更高的轉化率和立體選擇性。 5.磁性微球固定化HbHNL，與游離酶相比酶活保留了44％。放置時間為60天后，固定化酶的活性降低至原游離酶活力的38％，相同條件下的游離酶在放置60天后，酶活降低至原來的17％。固定化酶與游離酶相比，在微水相和雙相反應體系中反應的收率無明顯變化，但立體選擇性則有不

12、同程度提高。在循環(huán)催化苯乙醛、3，4-亞甲二氧基苯甲醛和3,4-亞甲二氧基苯乙醛手性羥腈化反應8次的過程中，均未見明顯的酶活喪失。循環(huán)催化5-苯并噻吩甲醛手性羥腈化反應第6次時，ee值開始下降顯著。 6.以磁性微球固定化HbHNL為催化劑，外消旋2-(苯并噻吩-5-基)-2-羥基乙腈為HCN供體，催化3,4-亞甲二氧基苯甲醛的手性羥腈化，反應最終的體系中含有7％的(S)-2-(3，4-亞甲二氧基苯基)-2-乙酰氧基乙腈，ee值為

13、97％，體系中63％的2-(苯并噻吩-5-基)-2-羥基乙腈，ee值為27％。 7.以等物質(zhì)的量的丙酮氰醇為HCN供體、加入10g/L的磁性微球固定化HbHNL，在0℃微水相體系中，催化3,4-亞甲二氧基苯丙酮的羥腈化反應，反應80min時ee值達到83％。 8.新來源的木瓜氧腈酶在含18％的檸檬酸緩沖液(0.1M、pH4.0)的MTBE溶液中，具有最佳催化性能。對于苯乙酮和碳鏈少于7個碳原子的脂肪族甲基酮都具有良好的催

14、化結果，但對于體積較大的芳酮和碳鏈多于7個碳原子的脂肪族甲基酮催化效果較差甚至不能轉化。從土壤中篩選出一株僅產(chǎn)S-選擇性氧腈酶的菌株，菌株的歸屬待定。 結論及意義： 1.以合成手性藥物中間體—手性α-氰醇為目的，以多種來源、不同立體選擇性的氧腈酶為生物催化劑，對苯乙醛、5-苯并噻吩甲醛、3,4-亞甲二氧基苯甲醛、3,4-亞甲二氧基苯乙醛和3,4-亞甲二氧基苯丙酮五種底物的手性羥腈化反應進行了系統(tǒng)研究，總體上以蘋果氧腈酶和

15、HbHNL催化分別得到R-和S-型手性α-氰醇的立體選擇性最高。 2.首次對HbHNL催化3,4-亞甲二氧基苯甲醛與硝基甲烷的反應進行了研究，探索了最適反應條件。 3.分別以多醛基葡聚糖和EupergitC為交聯(lián)劑和固定化載體，首次對蘋果氧腈酶粗蛋白進行了較好的固定。不僅酶活保留較好，而且與游離酶相比固定化酶催化底物手性羥腈化的收率和ee值均有不同程度的提高。在循環(huán)使用的次數(shù)上，以EupergitC為載體的固定化酶要優(yōu)于

16、以多醛基葡聚糖為交聯(lián)劑的固定化酶。為蘋果氧腈酶的批量催化及工業(yè)化應用奠定了基礎。 4.首次以磁性微球固定化法對HbHNL進行了固定化研究，固定化的HbHNL仍然保留了較高的催化活性，循環(huán)使用性能良好。與游離酶相比固定化HbHNL催化底物的立體選擇性更高。為HbHNL的應用提供了新的方便、價廉的固定化方法。 5.以外消旋2-(苯并噻吩-5-基)-2-羥基乙腈為HCN供體，以3,4-亞甲二氧基苯甲醛為底物，以磁性微球固定Hb