“溫、清、引”三法調(diào)節(jié)移植小鼠造血干細(xì)胞歸巢及GVHD作用.pdf

1、研究背景及目的： 異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneichematopoieticstemcelltransplantation，allo-HSCT)是治愈惡性血液病的最有效方法，但移植后出現(xiàn)的植入失敗(graftfailure,RF)、移植物抗宿主病(graftversushostdisease,GVHD)等并發(fā)癥影響了其治療效果。目前針對(duì)上述并發(fā)癥的治療方案效果有限，二次移植或供者淋巴細(xì)胞再輸注是RF的挽救性治療方法，但

2、這給患者帶來(lái)更大的移植風(fēng)險(xiǎn)，移植成功的機(jī)率更小。無(wú)論是急性移植物抗宿主病(acutegraftversushostdisease，aGVHD)，或是慢性移植物抗宿主病(chronicgraftversushostdisease,cGVHD)，糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢素都是一線治療藥物，但有效率50～60％，而耐藥患者只有5～30％，新型免疫抑制劑的應(yīng)用，或去除T細(xì)胞等方法，可減少aGVHD的發(fā)生，但相應(yīng)地增加了感染和復(fù)發(fā)的機(jī)會(huì)，患者的長(zhǎng)期生存率

3、并無(wú)明顯改善。因此如何有效解決上述難題，提高移植成功率，是移植界學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。中醫(yī)藥所具有的整體辨證和低副作用等特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，可望成為解決上述問(wèn)題的方法之一。本研究的目的，通過(guò)具有不同功效的方劑作用于不同的移植動(dòng)物模型，探索和建立一種有效干預(yù)和調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞歸巢和GVHD的中醫(yī)藥綜合方案，為解決移植難題打下基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)研究 本文開展了溫陽(yáng)補(bǔ)腎法調(diào)節(jié)移植小鼠造血干細(xì)胞歸巢、涼血解毒法干預(yù)異體移植小鼠aGVHD、引火歸元法干

4、預(yù)單倍體移植小鼠cGVHD等三個(gè)方面的研究，現(xiàn)分述如下： 一、溫陽(yáng)補(bǔ)腎法調(diào)節(jié)小鼠造血干細(xì)胞的歸巢 本課題以轉(zhuǎn)GFP基因的Balb/c熒光小鼠作為供鼠，以普通Balb/c小鼠為受鼠，進(jìn)行造血干細(xì)胞移植。移植前受鼠給予60co全身照射，劑量為9.0Gy，照射后6小時(shí)內(nèi)尾靜脈輸注骨髓細(xì)胞8×106個(gè)/0.5ml。移植后隨機(jī)分為5組，每組18只，分別為參附Ⅰ組、參附Ⅱ組、參附Ⅲ組、涼血解毒湯組、空白對(duì)照組，分別給予參附I湯(紅參

5、30g，熟附子15g)、參附II湯(紅參15g，熟附子15g)、參附III湯(紅參15g，熟附子30g)、涼血解毒湯(羚羊角粉3g(沖)、丹皮10g、赤芍10g、生地10g、貫眾10g、麥冬10g、田七3g、辛夷花10g、蒼耳子10g、甘草6g)以及生理鹽水等灌胃，移植后小鼠移入附帶空氣過(guò)濾帽的塑料透明鼠盒中喂養(yǎng)。于移植后第3、7、14天，分別抽取6只小鼠，留取骨髓、外周血、肝臟、皮膚、小腸等標(biāo)本，用于血常規(guī)、各組織熒光細(xì)胞、骨髓sca

6、-1+及其表面CD44及CD62L的表達(dá)等指標(biāo)的檢測(cè)。 結(jié)論：參附湯促進(jìn)造血干細(xì)胞歸巢的作用是通過(guò)提高造血干細(xì)胞表面粘附分子CD44及CD62L的表達(dá)，使干細(xì)胞緊密穩(wěn)定地粘附、穿行骨髓血竇內(nèi)皮，順利到達(dá)骨髓微環(huán)境，重建造血。這與人參味甘性溫，大補(bǔ)元?dú)?，附子辛甘大熱，回?yáng)益火等功效有關(guān)，經(jīng)二者配伍，則陽(yáng)氣充足，激發(fā)、推動(dòng)造血干細(xì)胞歸巢的動(dòng)力充足，可有力地促進(jìn)和推動(dòng)造血干細(xì)胞的歸巢。 二、涼血解毒法干預(yù)異體移植小鼠aGVHD

7、 本課題以清潔級(jí)Balb/c雄性小鼠作為供鼠，以清潔級(jí)C57BL/6雌性小鼠為受鼠，進(jìn)行異基因骨髓移植。移植前C57BL/6小鼠給予60co全身照射，劑量為9.0Gy，照射后4小鼠內(nèi)尾靜脈輸注骨髓細(xì)胞8×107個(gè)，只+脾細(xì)胞8×107個(gè)/只。移植后的小鼠隨機(jī)分為4組(單純照射組除外)，分別為安腦片組、桂附地黃丸組、小柴胡顆粒組、aGVHD空白組，每組10只。分別給予安腦片藥液(哈爾濱東方制藥生產(chǎn)，薄膜衣片，0.5g/片，由人工牛

8、黃、水牛角濃縮粉、豬膽汁粉、黃連、黃芩、郁金、珍珠母、珍珠、雄黃、冰片、朱砂、薄荷腦等藥物組成)、桂附地黃丸藥液(河南省宛西制藥生產(chǎn)，濃縮丸，3g/8粒，由干地黃、山藥、山茱萸(酒制)、澤瀉、茯苓、牡丹皮、肉桂、炮附子組成)、小柴胡顆粒(廣州白云山制藥生產(chǎn)，濃縮丸，3g/8丸，由柴胡、當(dāng)歸、白芍、炒白術(shù)、茯苓、薄荷、生姜、炙甘草組成)以及生理鹽水等灌胃，移植后小鼠移入附帶空氣過(guò)濾帽的塑料透明鼠盒中喂養(yǎng)。于移植后第30天，斷頸處死，留取骨

9、髓、外周血、肝臟、皮膚、小腸等標(biāo)本，用于血常規(guī)、骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、組織學(xué)、供受鼠混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)等指標(biāo)的檢測(cè)。 結(jié)論：安腦片可有效減輕異基因移植小鼠aGVHD的癥狀和程度，延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間，改善組織病理，抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，調(diào)控T淋巴細(xì)胞增殖，從而證實(shí)了涼血解毒法在aGVHD的治療作用。 為探討安腦片的干預(yù)aGVHD的機(jī)理，本文還開展了ELASA法檢測(cè)外周血清Th1/Th2比例，免疫組化觀察病理組織Th1/Th2的表達(dá)

10、等研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：aGVHD小鼠血清及病理組織中Th1/Th2的比例均是倒置的，病理組織中IFN-γ的表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，而IL-10的表達(dá)呈現(xiàn)弱陽(yáng)性或陰性反應(yīng)，經(jīng)安腦片干預(yù)后，血清及病理組織中IL-10的濃度提高，IFN-γ水平下降，與空白組相比，差異顯著(P=0.000)，提示安腦片可糾正aGVHD小鼠T細(xì)胞亞群的紊亂，調(diào)節(jié)Th1/Th2間的平衡。從免疫組化的總體評(píng)分上，aGVHD小鼠肝臟、小腸、皮膚4.64±0.35、4.24±1

11、.01、3.46±0.12，總分為14.11±1.21，安腦片組1.17±0.51、1.35±0.31、1.41±0.16，總分為3.93±0.72，兩者差異有顯著性意義(P=0.001)。由此得出：調(diào)節(jié)aGVHD小鼠體內(nèi)Th1/Th2間的平衡，誘導(dǎo)免疫耐受，減少因TH1類細(xì)胞因子分泌過(guò)多而造成的GVHD損害，是安腦片干預(yù)aGVHD的機(jī)理之一。 三、引火歸元法干預(yù)單倍體移植小鼠cGVHD 本課題以近交系清潔Balb/c雄

12、性小鼠作為供鼠，以其子代清潔級(jí)CB6F1雌性小鼠為受鼠，進(jìn)行單倍體骨髓移植。移植前CB6F1小鼠給予60co全身照射，劑量為9.5Gy，照射后4小時(shí)內(nèi)尾靜脈輸注骨髓細(xì)胞8×106個(gè)/只+脾細(xì)胞4.5×107個(gè)/只。移植后的小鼠隨機(jī)分為4組(單純照射組除外)，分別為桂附地黃丸組、安腦片組、小柴胡顆粒組、cGVHD空白組，每組24只。分別給予桂附地黃丸藥液(河南省宛西制藥生產(chǎn)，濃縮丸，3g/8粒，由干地黃、山藥、山茱萸(酒制)、澤瀉、茯苓、

13、牡丹皮、肉桂、炮附子組成)、安腦片藥液(哈爾濱東方制藥生產(chǎn)，薄膜衣片，0.5g/片，由人工牛黃、水牛角濃縮粉、豬膽汁粉、黃連、黃芩、郁金、珍珠母、珍珠、雄黃、冰片、朱砂、薄荷腦等藥物組成)、小柴胡顆粒(廣州白云山制藥生產(chǎn)，濃縮丸，3g/8丸，由柴胡、當(dāng)歸、白芍、炒白術(shù)、茯苓、薄荷、生姜、炙甘草組成)以及生理鹽水等灌胃，移植后小鼠移入附帶空氣過(guò)濾帽的塑料透明鼠盒中喂養(yǎng)。于移植后第7、14、30、100天，隨機(jī)抽取6只小鼠，留取骨髓、外周血

14、、肝臟、皮膚、小腸等標(biāo)本，用于骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓造血組織容量、組織學(xué)、GeneScan分析小鼠T細(xì)胞克隆等指標(biāo)的檢測(cè)。 結(jié)論：桂附地黃丸可改善或消除TCR的優(yōu)勢(shì)表達(dá)，這一作用可能與桂附地黃丸減輕同種異型抗原的刺激有關(guān)。桂附地黃丸的干預(yù)效果是明顯的。 為探討桂附地黃丸的干預(yù)機(jī)理，本文還開展了流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+/CD8+比例、ELASA法檢測(cè)Th1/Th2比例等研究。研究表明：桂附地黃丸干預(yù)cGVHD的機(jī)制之一是通過(guò)

15、調(diào)節(jié)cGVHD小鼠體內(nèi)血清及組織Th1/Th2間的平衡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 全文小結(jié)： 1、具有溫陽(yáng)補(bǔ)腎作用的參附湯能夠促進(jìn)造血干細(xì)胞的歸巢，其促進(jìn)造血干細(xì)胞歸巢的效果與附子的劑量相關(guān)，而提高造血干細(xì)胞表面粘附分子CD44及CD62L的表達(dá)水平是其促進(jìn)造血干細(xì)胞歸巢的作用機(jī)制之一。 2、具有涼血解毒作用的安腦片可有效減輕異體移植小鼠aGVHD的癥狀和程度，延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間，改善組織病理，抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和殺傷活性，調(diào)控

16、T淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)免疫耐受。其干預(yù)作用是通過(guò)如下機(jī)制實(shí)現(xiàn)的：通過(guò)調(diào)節(jié)aGVHD小鼠體內(nèi)Th1/Th2間的平衡，誘導(dǎo)免疫耐受，減少因TH1類細(xì)胞因子分泌過(guò)多而造成的GVHD損害。 3、具有引火歸元作用的桂附地黃丸可延長(zhǎng)cGVHD小鼠的存活時(shí)間，改善組織病理，減輕cGVHD的癥狀和程度，減少T細(xì)胞的寡克隆增殖，促進(jìn)T細(xì)胞增殖的多樣化。調(diào)節(jié)了CD4+/CD8+、Th1/Th2間的平衡是它干預(yù)cGVHD效果的機(jī)制之一。 4、綜

17、合上述研究成果，初步建立中醫(yī)藥干預(yù)造血干細(xì)胞移植的綜合治療方案：即根據(jù)移植后造血干細(xì)胞歸巢、aGVHD和cGVHD的不同時(shí)期，先后實(shí)施溫、清、引三法，溫陽(yáng)補(bǔ)腎法促進(jìn)造血干細(xì)胞的歸巢：aGVHD初期實(shí)施涼血解毒、后期實(shí)施溫陽(yáng)解毒的方法防治aGVHD；原發(fā)型和復(fù)發(fā)型cGVHD，實(shí)施引火歸元法，進(jìn)展型cGVHD，實(shí)施補(bǔ)腎解毒法。這就是平衡陰陽(yáng)法則在移植臨床的具體運(yùn)用。 創(chuàng)新性： 1、運(yùn)用中醫(yī)腎精腎氣關(guān)系理論、中醫(yī)毒邪理論以及命