hWJMSCs向膀胱尿路上皮分化及抑制尿路上皮腫瘤生長(zhǎng)的研究.pdf

1、第一部分hWJMSCs向膀胱尿路上皮細(xì)胞分化的研究
　　目的:臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstromalcellsderivedfromhumanumbilicalcordWharton'sjelly，hWJMSCs)是一群具有多向分化潛能的原始細(xì)胞。既往的研究證實(shí)，骨髓、脂肪等組織來(lái)源的MSCs在合適的條件下可以向膀胱尿路上皮細(xì)胞分化。hWJMSCs能否被誘導(dǎo)分化為膀胱尿路上皮細(xì)胞尚不明確。本部分中，我們旨在評(píng)估hW

2、JMSCs向膀胱尿路上皮細(xì)胞分化的可行性。方法:首先，我們采用組織塊貼壁法在從臍帶沃頓膠質(zhì)中分離獲取原代培養(yǎng)的hWJMSCs，并對(duì)其表面CD分子進(jìn)行鑒定。然后，采用人膀胱尿路上皮細(xì)胞系及豬原代膀胱尿路上皮細(xì)胞來(lái)源的條件培養(yǎng)基、人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)對(duì)hWJMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化。針對(duì)定向分化過(guò)程中特定時(shí)間的hWJMSCs采用RT-PCR及細(xì)胞免疫熒光染色的方法檢測(cè)其尿路上皮細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白(尿斑蛋白UPⅡ、細(xì)胞角質(zhì)蛋白AE1/AE3、C

3、K18)表達(dá)情況。結(jié)果:我們?cè)囵B(yǎng)的hWJMSCs外形均一、增殖旺盛，表達(dá)MSCs相關(guān)CD分子，不表達(dá)血源性細(xì)胞CD分子。數(shù)據(jù)顯示，在單獨(dú)使用人膀胱尿路上皮細(xì)胞系及豬原代膀胱尿路上皮細(xì)胞來(lái)源的條件培養(yǎng)基或者EGF對(duì)hWJMSCs進(jìn)行分化的第7天、第14天甚至第28天均沒(méi)能檢測(cè)出尿斑蛋白UPⅡ、細(xì)胞角質(zhì)蛋白AE1/AE3、CK18的表達(dá)。而聯(lián)合使用條件培養(yǎng)基及外源性的人EGF后，hWJMSCs在被定向誘導(dǎo)分化第7天即有微弱的尿斑蛋白UP

4、Ⅱ、細(xì)胞角質(zhì)蛋白AE1/AE3、CK18表達(dá)，當(dāng)繼續(xù)誘導(dǎo)分化至第14天時(shí)，上述蛋白標(biāo)記物表達(dá)程度明顯增強(qiáng)，并且hWJMSCs形態(tài)也由長(zhǎng)梭形向多邊形轉(zhuǎn)變。
　　結(jié)論:本課題中采用的hWJMSCs原代培養(yǎng)方法可以成功地獲取純度較高、生長(zhǎng)旺盛的hWJMSCs，完全可以滿足本實(shí)驗(yàn)的需要。無(wú)論是來(lái)源于人或豬膀胱尿路上皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基還是人EGF單獨(dú)使用均不足以誘導(dǎo)hWJMSCs向尿路上皮樣細(xì)胞定向分化。而添加有人EGF的情況下，上述條件培

5、養(yǎng)基則可以成功地誘導(dǎo)hWJMSCs向膀胱尿路上皮細(xì)胞進(jìn)行分化。
　　第二部分hWJMSCs及hWJMSC-MVs抑制膀胱尿路上皮腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的研究
　　目的:有研究證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可以發(fā)揮抗腫瘤的作用，但其潛在的具體分子機(jī)制目前尚不明確。近些年，細(xì)胞分泌的微囊(microvesicles，MVs)被認(rèn)為是細(xì)胞與細(xì)胞之間信息傳遞的一種新途徑，因此，微囊有可能在MSCs的抗腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。在本部分實(shí)驗(yàn)中，

6、我們旨在驗(yàn)證臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hWJMSCs)及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微囊(hWJMSC-MVs)在體外及體內(nèi)對(duì)膀胱尿路上皮細(xì)胞腫瘤細(xì)胞（T24細(xì)胞）生長(zhǎng)的抑制作用，并初步探討該現(xiàn)象背后的分子機(jī)制。方法:我們選用細(xì)胞共培養(yǎng)體系及BALB/cnu/nu裸鼠腫瘤模型分別驗(yàn)證在體外及體內(nèi)環(huán)境下hWJMSCs及hWJMSC-MVs對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。采用CCK-8試劑盒及Ki-67免疫染色的方法檢測(cè)hWJMSCs及hWJMSC-MVs

7、處理后的膀胱腫瘤細(xì)胞(T24)的增殖情況。采用流式細(xì)胞技術(shù)及TUNEL染色技術(shù)評(píng)估膀胱腫瘤細(xì)胞周期變化及腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)的改變。為了探討hWJMSCs及hWJMSC-MVs抑制膀胱腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)通路，我們采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)膀胱腫瘤細(xì)胞暴露于hWJMSC-MVs24h、48h、72h后Akt/p-Akt、p-p53、p21及Caspase3的活化及表達(dá)變化。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，膀胱腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)hWJMSCs及hWJMS

8、C-MVs處理后，其增殖率明顯下降，細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期，腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)增加。Westernblot檢測(cè)顯示，hWJMSC-MVs降低了腫瘤細(xì)胞Akt磷酸化水平，激活了p53、p21及Caspase3。在動(dòng)物模型中，同時(shí)皮下注射hWJMSCs或hWJMSC-MVs組的裸鼠，腫瘤成瘤率降低、瘤體體積減小。
　　結(jié)論:hWJMSCs及hWJMSCs-MVs通過(guò)阻滯腫瘤細(xì)胞周期并促進(jìn)其凋亡的方式抑制膀胱腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。并且，h