乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)A181T-V變異的相關(guān)研究.pdf

1、背景:
　　 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性分布，盡管乙肝疫苗已經(jīng)普及了20年，但全球仍有20億人感染過(guò)HBV，其中2.4億為慢性感染。我國(guó)的慢性HBV感染者有9300萬(wàn)，其中2000萬(wàn)是慢性乙型肝炎患者。
　　 治療慢性乙型肝炎最重要的手段是控制HBV復(fù)制，以減輕和延緩病情的發(fā)展。目前主要有兩大類(lèi)抗病毒藥物:干擾素和核苷（酸）類(lèi)似物。由于核苷（酸）類(lèi)似物服用方便，作用效果強(qiáng)、不良

2、反應(yīng)少，已被越來(lái)越多的慢性乙型肝炎患者所接受。但在長(zhǎng)期抗病毒治療的同時(shí)，HBV會(huì)在藥物的壓力下獲得適應(yīng)性變異，產(chǎn)生耐藥病毒株，導(dǎo)致治療的失敗。臨床上輕則引起患者病情的進(jìn)展，重則誘發(fā)肝硬化、肝衰竭等。因此耐藥相關(guān)的研究已受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。
　　 關(guān)于核苷（酸）類(lèi)似物耐藥的位點(diǎn)大多都集中在HBV逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase，RT)區(qū)的A至D結(jié)構(gòu)域內(nèi)。研究表明，目前能引起HBV耐藥的5條通路中有2條通路都和

3、B結(jié)構(gòu)域rtA181 T/V變異相關(guān)，這是一個(gè)交叉核苷和核苷酸兩大類(lèi)藥物的交叉耐藥位點(diǎn)，對(duì)目前幾乎所有核苷（酸）類(lèi)似物均呈現(xiàn)一定的耐藥性。對(duì)rtA181T/V變異的研究有著深刻的意義。
　　 HBV基因組是短小而高效精干的，其中67％的基因組重疊編碼，一段序列可重復(fù)編碼1.5次。逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的突變同樣可以導(dǎo)致表面抗原S區(qū)編碼氨基酸的改變。rtA181T變異后可引起S區(qū)氨基酸提前產(chǎn)生終止密碼子，而使表面抗原截短;rtA181V變異后

4、可引起表面抗原出現(xiàn)氨基酸的置換，那么這種對(duì)表面抗原的影響差異在臨床上和實(shí)驗(yàn)室中是否一致？HBV在復(fù)制和傳播中同時(shí)受到宿主免疫和藥物壓力的影響。除了核苷（酸）類(lèi)似物的耐藥主要發(fā)生在RT區(qū)，rtA181T/V變異病毒株的C區(qū)變異情況又如何呢？
　　 隨著臨床可選核苷（酸）類(lèi)似物的增加，耐藥變異的形式也呈現(xiàn)多樣化、復(fù)雜化。不同的多藥耐藥位點(diǎn)出現(xiàn)是臨床所面臨的新挑戰(zhàn)，有很多針對(duì)這方面的研究，但大多是對(duì)直接測(cè)序的結(jié)果而展開(kāi)。這樣并不能分清

5、不同的變異位點(diǎn)在同一株病毒上，還是不同的病毒株之間，因此有必要對(duì)其采用克隆后測(cè)序的方法，對(duì)宿主體內(nèi)病毒準(zhǔn)種進(jìn)行詳盡的分析，了解病毒的變異特點(diǎn)。
　　 基因型可能影響病情發(fā)展和預(yù)后。我國(guó)慢性乙型肝炎患者主要是B基因型和C基因型，rtA181T/V變異在這兩種不同基因型間是否存在選擇，不同基因型的rtA181T/V變異表現(xiàn)是否一致？因此，有待對(duì)上述諸多問(wèn)題進(jìn)行詳盡的分析，為臨床抗病毒治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 第一章、乙型肝炎

6、病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)181位點(diǎn)變異的臨床特征分析
　　 目的:
　　 探討rtA181變異和臨床抗病毒用藥的關(guān)系，變異后患者臨床特征的變化，rtA181變異的模式，與我國(guó)B、C基因型的關(guān)系，以及A181位點(diǎn)不同變異之間的差異。
　　 方法:
　　 1、篩選經(jīng)核苷（酸）類(lèi)似物治療產(chǎn)生rtA181變異的慢性乙型性肝炎患者，納入研究的85例患者符合《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》診斷。對(duì)所有患者抗病毒治療期間

7、的相關(guān)臨床資料進(jìn)行回顧，并對(duì)發(fā)生耐藥時(shí)的患者肝功能、表面抗原、e抗原、HBV DNA等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果確定基因型。
　　 2、所有數(shù)據(jù)均使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析?；颊哔Y料中計(jì)數(shù)資料構(gòu)成比采用R×C表的x2檢驗(yàn)，定量資料采用用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P值小于0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1、RT區(qū)A181位點(diǎn)變異的主要模式有8種:A181T、A181V、A181T+N236

8、T、A181V+N236T、A181T+A181V、A181T+M204I/V±L180M±V173L、A181V+M204I/V±L180M±V173L、A181T+N236T+M204I等。84例(98.82％)患者接受過(guò)阿德福韋治療。rtA181T/V變異在阿德福韋治療組中有9例，而在拉米夫定換用阿德福韋治療組中有33例，其分布存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P=0.046);rtA181T/V+rtN236T變異模式在兩組中分別為16例和1

9、1例，兩者比較亦存在顯著差異(P＜0.001);而rtA181T/V+rtM204I/V變異在兩不同治療組中分布同樣存在差異(P=0.016)。
　　 2、與抗病毒治療前相比，盡管發(fā)生rtA181耐藥變異，患者臨床相關(guān)指標(biāo)仍可能有所改善。反映肝功能的ALT由抗病毒治療前的175±130U/L下降至82±49U/L（P＜0.001）;反映病毒復(fù)制狀態(tài)的HBV DNA由5.97±1.26 log10copies/mL下降至4.10±

10、1.18 log10 copies/mL(P＜0.001);病毒的表面抗原(HBsAg)由3.66±0.36 log10 COI下降到3.50±0.45 log10 COI（P=0.013）。但是患者HBeAg狀態(tài)在治療前后變化不大(P=0.973)。
　　 3、85患者中，13例(15.7％)為B基兇型，72例(84.3％)為C基因型，未見(jiàn)其他基因型。B基因型患者中rtA181T變異4例，rtA181V變異9例;C基因型中rt

11、A181T變異40例，rtA181V變異30例，rtA181T+rtA181V變異2例。不同變異在基因型分組中統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)差異(P＞0.05)。
　　 4、按照B、C基因型分組，兩組患者在抗病毒治療前臨床資料相近，未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。在出現(xiàn)耐藥時(shí)的相關(guān)臨床特征（ALT、HBsAg、HBV DNA、HBeAg等）亦沒(méi)有表現(xiàn)出明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 5、按照rtA181T和rtA181V不同變異分組，

12、患者在抗病毒治療前的一般資料、生化指標(biāo)、病毒水平、表面抗原水平、e抗原狀態(tài)等方面比較無(wú)差異(P＞0.05)，但在出現(xiàn)變異耐藥時(shí)，rtA181T突變組的HBsAg水平較rtA181V組低（3.40±0.351gCOI vs.3.62±0.541g COI，P=0.030）。與抗病毒前相比，rtA181T變異患者出現(xiàn)耐藥時(shí)的生化、病毒指標(biāo)明顯下降(P＜0.05);而rtA181V變異患者耐藥時(shí)病毒量和轉(zhuǎn)氨酶明顯改善(P＜0.001)，但HB

13、sAg水平似乎變化不明顯(P=0.315)。
　　 結(jié)論:
　　 1、rtA181變異主要和阿德福韋用藥有關(guān)。rtA181T/V變異在拉米夫定換用（或加用）阿德福韋的治療患者中多見(jiàn);而A181T/V+N236T變異多出現(xiàn)在單用阿德福韋治療的患者中。
　　 2、rtA181T/V變異后病情可能不出現(xiàn)大的反彈。
　　 3、B、C基因型對(duì)rtA181變異無(wú)明顯影響。不同變異模式在B、C基因型中的分布無(wú)差異;不同

14、基因型患者變異后的臨床指標(biāo)也相近。
　　 4、rtA181T變異和rtA181V變異患者在抗病毒治療前的臨床資料統(tǒng)計(jì)無(wú)差異。但在發(fā)生變異時(shí)，rtA181T變異組的HBsAg水平較rtA181V組的低。
　　 第二章、乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)181位點(diǎn)變異的病毒學(xué)特點(diǎn)分析
　　 目的:
　　 探討HBV rtA181變異病毒的準(zhǔn)種特點(diǎn)，以及不同變異中前C區(qū)G1896A及BCP區(qū)A1762T/G1764A變異的

15、情況。
　　 方法:
　　 1、選部分標(biāo)本對(duì)HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，純化回收后插入pMD18T載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌。對(duì)每個(gè)樣本挑選18個(gè)以上的克隆進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)VectorNTI軟件進(jìn)行組裝拼接，并用Chromatogram軟件比對(duì)測(cè)序峰圖，MEGA4、BioEdit軟件比對(duì)序列，分析病毒準(zhǔn)種特點(diǎn)。
　　 2、對(duì)所有標(biāo)本PCR擴(kuò)增C基因區(qū)nt1623～ nt2076，產(chǎn)物直接測(cè)序后分析BCP、pC變異與rt

16、A181變異的關(guān)系。
　　 3、前C區(qū)和基本核心啟動(dòng)子變異分析采用計(jì)數(shù)資料的x2檢驗(yàn)。P值小于0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS13.0軟件進(jìn)行。
　　 結(jié)果:
　　 1、檢測(cè)到位于同一病毒株上的rtA181相關(guān)耐藥組合有:A181T+M204V、A181T+N236T、A181V+N236T, A181T+V173L、L180M+181V和A181T+N236T+M250L，尚未發(fā)現(xiàn)L180M+

17、181T組合耐藥變異株。
　　 2、rtA181T變異株在其病毒準(zhǔn)種中所占比例為14.3％～95.2％; rtA181V變異株在病毒準(zhǔn)種的比例為60.0％～100.0％。全部為rtA181V變異病毒準(zhǔn)群的基因組距離和熵值相對(duì)較低。克隆分析還發(fā)現(xiàn)PCR直接測(cè)序不能檢測(cè)到的rtA181D和rtA181L變異。
　　 3、C基因核心啟動(dòng)子A1762T和G1764A雙突變?cè)趓tA181T變異組的比例明顯較rtA181V變異組高(

18、P=0.009)，而前C區(qū)G1896A位點(diǎn)突變?cè)趓tA181變異組合CHB對(duì)照組間并沒(méi)有表現(xiàn)出顯著差異(P=0.144)。
　　 結(jié)論:
　　 1、鑒定出多種同一病毒株上的rtA181T/V伴隨的組合耐藥變異形式。
　　 2、rtA181T變異病毒準(zhǔn)種中?；煊幸吧筒《局?。rtA181變異除了常見(jiàn)的rtA181T和rtA181V變異外，還可有rtA181D和rtA181L等變異。
　　 3、BCP突變?cè)趓

19、tA181T變異組中出現(xiàn)比例高于rtA181V變異組，高于慢乙肝對(duì)照組。
　　 第三章、不同基因型1.24拷貝乙型肝炎病毒rtA181T/V突變株的構(gòu)建
　　 目的:
　　 為進(jìn)一步比較rtA181變異在不同基因型之間的生物學(xué)特點(diǎn)，構(gòu)建rtA181T和rtA181V突變質(zhì)粒，為下一步體外實(shí)驗(yàn)提供必要的條件。
　　 方法:
　　 1、利用Mizokami教授惠贈(zèng)的Ae-JPN、Ba-JPN58、C-

20、JPNAT、D-US68四株1.24拷貝HBV不同基因型的重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)錯(cuò)配堿基引物，通過(guò)重疊延伸PCR的方法，獲得人工定點(diǎn)突變RT區(qū)相應(yīng)片段，利用XbalⅠ和SphⅠ兩個(gè)單酶切位點(diǎn)，與野生病毒株相應(yīng)序列置換，獲得不同基因型rtA181T突變和rtA181V突變病毒株。
　　 2、采用引物M13F和M13R對(duì)構(gòu)建突變質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定;利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，以及EcoRⅠ單酶切對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切

21、鑒定，初步鑒定重組突變質(zhì)粒。對(duì)各基因型分別取3株rt181T突變株和rt181V突變株克隆，對(duì)插入片段DNA進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)突變質(zhì)粒的正確構(gòu)建。
　　 結(jié)果:
　　 構(gòu)建不同基因型的rtA181T突變和rtA181V突變的pUC-HBV1.24質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切和核苷酸序列測(cè)定結(jié)果均與預(yù)期相符;pUC-HBV1.24-181T質(zhì)粒的FLLA基序氨基酸突變?yōu)镕LLT，而pUC-HBV1.24-181V質(zhì)粒的相應(yīng)氨基酸突

22、變?yōu)镕LLV，并且與野生型質(zhì)粒相比，未引入其他突變位點(diǎn)。
　　 結(jié)論:
　　 經(jīng)體外突變重組，成功構(gòu)建了不同基因型rtA181T/V突變的1.24拷貝的HBV全基因突變株。
　　 第四章、不同基因型乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)181位點(diǎn)變異株體外特性研究
　　 目的:
　　 比較A、B、C、D四種基因型的rtA181T和rtA181V耐藥變異病毒在體外細(xì)胞學(xué)水平上的生物學(xué)特性，為臨床抗病毒及挽救治療提供

23、理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、利用OMEGA公司的Endo-Free中量質(zhì)粒抽提試劑盒提取Ae-JPN、Ba-JPN58、C-JPNAT、D-US68四種野生型和rtA181T/V突變病毒質(zhì)粒，以及pSEAP質(zhì)粒。
　　 2、HepG2細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)后，按1.5×106細(xì)胞/每孔接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度80～85％時(shí)，利用X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑按1∶3的比例，分別將pUC-H

24、BV1.24-181T或pUC-HBV1.24-181V質(zhì)粒(5ug)和pSEAP報(bào)告基因質(zhì)粒(0.1ug)共轉(zhuǎn)染，并設(shè)置空轉(zhuǎn)對(duì)照。轉(zhuǎn)染48～72小時(shí)后收集細(xì)胞上清進(jìn)行HBsAg和HBV DNA的檢測(cè)。
　　 2、模擬宿主體內(nèi)混合病毒株?duì)顟B(tài)，將不同基因型的rtA181T突變質(zhì)粒與其野生型質(zhì)粒分別按0∶1、1∶0、1∶1、1∶9四種不同比例混合(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒總量為5ug)，與0.1 ug pSEAP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48～

25、72小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞上清中HBsAg和HBV DNA水平。
　　 4、利用SEAP試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中分泌性堿性磷酸酶(SEAP)的表達(dá)，以此平衡各組轉(zhuǎn)染效率，并以各基因型的野生型質(zhì)粒為對(duì)照換算相關(guān)結(jié)果。
　　 5、同一基因型之間統(tǒng)計(jì)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。若方差不齊，采用Satterthwaite近似t檢驗(yàn)。不同基因型之間統(tǒng)計(jì)采用單向方差分析(One-Way ANOVA)。HBVDNA在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)前先進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。
　　

26、 結(jié)果:
　　 1、rtA181T突變后明顯影響HBsAg的分泌，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBsAg幾乎檢測(cè)不出，只有各野生型0.33％～2.22％;而rtA181V突變后影響相對(duì)較小，HBsAg水平能維持在野生型的80％以上。各基因型中rtA181T突變和rtA181V突變之間HBsAg比較均存在顯著差異(P＜0.001)。
　　 2、rtA181T突變明顯影響HBV顆粒的合成，大部分細(xì)胞上清中檢測(cè)不到HBV顆粒，即使檢測(cè)到

27、也是較低，在102拷貝/mL水平。各基因型的rtA181T突變和rtA181V突變之間病毒顆粒的分泌均存在明顯差異。
　　 3、不同基因型rtA181T突變質(zhì)粒的HBsAg水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.563，P=0.272）;而不同基因型rtA181V突變質(zhì)粒的HBsAg水平存在差異(F=6.261，P=0.017)，A、D基因型的HBsAg水平比B基因型的水平高。
　　 4、rtA181V突變質(zhì)粒的HBV DNA水平

28、在不同基因型間存在差異(F=25.630，P＜0.01)，具體表現(xiàn)為B、C基因型的DNA水平較A和D基因型的低。
　　 5、rtA181T突變株與野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，HbsAg表達(dá)缺陷能夠得到部分糾正。當(dāng)野生型質(zhì)粒比例占10％時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中能檢測(cè)到少量HBsAg;當(dāng)野生型質(zhì)粒比例提高到50％左右，HBsAg水平能恢復(fù)高到50％左右。組間進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn):在野生質(zhì)粒50％的情況下，不同基因型的HBsAg水平存在差異(F=4.79

29、9，P=0.034)。A基因型的相對(duì)活性較高、而D基因型的活性相對(duì)較低。在野生質(zhì)粒10％和0的情況下，不同基因型之間HBsAg水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 6、rtA181T突變株和野生株共轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞上清中的HBV DNA表達(dá)情況也和HBsAg近似。隨著野生型質(zhì)粒濃度的提高，病毒表達(dá)情況也逐漸提高，野生型質(zhì)粒50％的時(shí)候，HBV DNA水平已達(dá)到40％以上。但在不同比例的混合質(zhì)粒中，不同基因型之間比較均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異