AM和BAM22在疼痛中的作用.pdf

1、腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，AM)是CGRP家族的一員，在結(jié)構(gòu)和功能上與CGRP有一定的相似性。最近研究表明AM是一種與疼痛有關(guān)的神經(jīng)肽。內(nèi)源性阿片肽牛腎上腺髓質(zhì)22肽(Bovine adrenal medulla22 peptides，BAM22)可通過與μ-、δ-和κ-阿片受體結(jié)合參與了傷害性信息的調(diào)控。但它們在炎癥痛和神經(jīng)病理性痛的作用尚不清楚。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了行為學(xué)、免疫組織化學(xué)技術(shù)。研究了AM在正常大鼠脊

2、髓背角和DRG的表達(dá)情況；觀察AM特異性受體拮抗劑AM22-52對CFA炎癥模型大鼠熱痛覺閾值，AM、CGRP和nNOS表達(dá)的影響，探討AM及其受體在炎癥過程中的作用：研究神經(jīng)損傷后DRG中BAM22的表達(dá)，探討B(tài)AM22對神經(jīng)病理性痛的作用，進(jìn)一步了解神經(jīng)病理性痛的發(fā)病機(jī)制。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：足底注射CFA會引起脊髓背角淺層和DRG中小型神經(jīng)元AM-IR的表達(dá)增加：鞘內(nèi)注射AM受體特異性拮抗劑AM22-52，翻轉(zhuǎn)了CFA引起的熱痛覺

3、閾值降低及脊髓背角和DRG內(nèi)AM、CGRP、nNOS的表達(dá)增加：L5脊神經(jīng)結(jié)扎后，結(jié)扎側(cè)IA-6中DRG BAM22－IR，IB4+細(xì)胞和雙標(biāo)細(xì)胞都明顯降低，L5下降最明顯。結(jié)果提示：脊髓背角和DRG中的AM參與了傷害性信息的傳遞，其作用是通過激活A(yù)M受體來實(shí)現(xiàn)的。BAM22可表達(dá)于非肽能類神經(jīng)元中。神經(jīng)結(jié)扎后，結(jié)扎側(cè)DRG神經(jīng)元BAM22表達(dá)下調(diào)，提示內(nèi)源性阿片肽減少，可能是神經(jīng)病理痛的發(fā)病機(jī)制之一。 腎上腺髓質(zhì)素(adren

4、omedullin，AM)是CGRP家族的一員，在結(jié)構(gòu)和功能上與CGRP有一定的相似性。具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括擴(kuò)張血管，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和抗炎型等特性。AM在傷害性感受中的作用還不清楚。最近研究表明AM是一種與疼痛有關(guān)的神經(jīng)肽。在大鼠脊髓、背根神經(jīng)節(jié)(DRG)肽能和非肽能神經(jīng)感受器中都有廣泛分布。但其在炎癥痛中的作用尚不清楚，本研究應(yīng)用行為學(xué)、免疫組織化學(xué)技術(shù)，探討AM在大鼠脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion

5、，DRG)中的分布和細(xì)胞學(xué)定位，及AM受體在炎癥維持階段的作用機(jī)制。 神經(jīng)病理性疼痛是由于中樞或外周神經(jīng)組織損傷后神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能改變而導(dǎo)致的痛覺異常和痛覺過敏。常用的神經(jīng)病理性痛模型有慢性坐骨神經(jīng)損傷模型(CCI)、脊神經(jīng)結(jié)扎模型(SNL)和坐骨神經(jīng)分支選擇切斷(SNI)等。對神經(jīng)病理性痛的治療，很多治療方法的療效不明顯，尤其是臨床應(yīng)用的麻醉性鎮(zhèn)痛藥如嗎啡對多種神經(jīng)源性痛療效甚微。因此尋找一種有效的鎮(zhèn)痛藥是臨床上治療神經(jīng)病理

6、性痛的關(guān)鍵。 牛腎上腺髓質(zhì)22肽(Bovine adrenal medulla 22 peptides，BAM22)是前腦啡肽A(proenkephalin A，內(nèi)源性Met-和Leu-腦啡肽的前體)的一種降解產(chǎn)物。在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中都有分布，BAM22通過與μ－、δ－阿片受體結(jié)合抑制感覺神經(jīng)末梢釋放興奮性遞質(zhì)，而抑制痛信息傳入中樞，可以推測BAM22可能參與傷害性信息的調(diào)控并在內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。我們實(shí)驗(yàn)室之前

7、的研究表明，DRG是BAM22重要的合成部位之一，參與炎癥痛的自我保護(hù)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究神經(jīng)病理痛是否導(dǎo)致DRG內(nèi)BAM22的可塑性變化，探討內(nèi)源性阿片肽在神經(jīng)病理性痛中的作用，有助于我們進(jìn)一步了解神經(jīng)病理性痛的發(fā)病機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)康陌ㄒ韵聨讉€方面：(1)研究AM在正常大鼠脊髓背角和DRG的表達(dá)情況；(2)運(yùn)用微量注射拮抗劑的方法，觀察AM特異性受體拮抗劑AM22-52對CFA炎癥模型大鼠熱痛覺閾值，AM

8、、CGRP和nNOS表達(dá)的影響，探討AM及其受體在炎癥過程中的作用；(3)研究神經(jīng)損傷后DRG中BAM22的表達(dá)，探討B(tài)AM22對神經(jīng)病理性痛的作用，進(jìn)一步了解神經(jīng)病理性痛的發(fā)病機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法： (1)采用大鼠一側(cè)后足掌皮下CFA建立炎性痛模型。運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測了正常和CFA炎癥大鼠脊髓背角及DRG中AM的表達(dá)。(2)以縮足反射潛伏期(pawwithdrawal latency，PWL)作為痛閾指標(biāo)，觀察足底注射C

9、FA 24h后鞘內(nèi)注射AM特異性受體拮抗劑AM22-52對CFA炎癥大鼠的PWL的影響。(3)運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測鞘內(nèi)注射AM22-52后脊髓AM和CGRP的表達(dá)情況及DRG神經(jīng)元AM、nNOS和CGRP的表達(dá)情況。(4)熒光免疫組化檢測SNL大鼠，結(jié)扎的L5背根神經(jīng)節(jié)中BAM22的表達(dá)情況。(5)運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)，檢測SNL大鼠，L4/6背根神經(jīng)節(jié)中BAM22和IB4的共存情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 通過實(shí)驗(yàn)，我們得出以

10、下結(jié)果： (1)正常大鼠脊髓切片經(jīng)AM免疫組織化學(xué)染色，觀察到大鼠腰段脊髓的背角淺層都有AM免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物(AM-immunoreactivity，AM-IR)的分布，其中在I-H層的分布密集，著色較深，在第V層也可見弱到中等強(qiáng)度的陽性反應(yīng)。在腰髓灰質(zhì)其余各層，AM-IR極弱或陰性。鏡下可見：AM-IR在大、中、小各型神經(jīng)元中均有表達(dá)，主要集中在神經(jīng)元的核周質(zhì)，核及突起中。經(jīng)軟件分析，在注射生理鹽水(正常大鼠)同側(cè)LA-6DR

11、G中，DRG大、中、小三種亞型神經(jīng)元中表達(dá)AM-IR神經(jīng)元比例分別為：6.9％、29.2％和42.1％。 (2)足底注射CFA 48h后，注射同側(cè)，L4-6 DRG神經(jīng)元內(nèi)AM-IR的表達(dá)量較生理鹽水組增加了，尤其以中、小型細(xì)胞增加最為顯著。CFA注射對側(cè)各型神經(jīng)元的表達(dá)量與生理鹽水組相比無明顯變化。 (3)大鼠右后足皮下注射CFA 150 μl后，4 h左右動物對熱刺激的痛閾值會降低，48h痛閾值仍明顯低于注射CFA前

12、的基礎(chǔ)值；24h鞘內(nèi)注射AM22-52(10 nmol)，48h的熱刺激痛閾值明顯高于同期的CFA組。 (4)鞘內(nèi)注射AM22-52后，同側(cè)脊髓背角淺層(I、II層)仍然有AM-IR表達(dá)。I、II層內(nèi)有少量陽性的胞體，背角深層內(nèi)免疫染色淺，有少量陽性的中小型細(xì)胞散在分布于III層和V-VI層的外側(cè)部。腹角運(yùn)動神經(jīng)元為陰性。兩側(cè)脊髓免疫染色未見明顯差異。 (5)鞘內(nèi)注射AM22-52后，大鼠的L4-6 DRG神經(jīng)元中，AM

13、-IR主要分布于DRG的中、小型神經(jīng)元內(nèi)，大型神經(jīng)元也有少量表達(dá)。一側(cè)足底注射CFA 24h后，鞘內(nèi)注射AM22-52，L4-6 DRG內(nèi)AM-IR的在大、中、小型神經(jīng)元中的分布和表達(dá)與對側(cè)相比都無明顯差異。CFA注射側(cè)AM-IR在DRG各型神經(jīng)元中的表達(dá)量與對側(cè)相比無明顯差異。 (6)熒光免疫組化實(shí)驗(yàn)表明，在脊髓背角淺層(板層I-II層)CGRP陽性神經(jīng)纖維和終末呈致密狀連接成片，亮度較大，CFA注射側(cè)表達(dá)較Saline注射側(cè)

14、明顯的亮，而鞘內(nèi)注射AM22-52后，背角的CGRP免疫熒光強(qiáng)度減弱。 (7)DRG切片經(jīng)CGRP免疫組織化學(xué)染色，在鏡下可見：CGRP－IR在大、中、小各類感覺神經(jīng)元中均有分布，主要集中在神經(jīng)元的核周質(zhì)，核及突起中。足底注射CFA 48h后，注射側(cè)L4-6 DRG神經(jīng)元內(nèi)CGRP-IR的表達(dá)急劇增加，尤其以中、小型細(xì)胞增加最為顯著；對側(cè)各型神經(jīng)元的表達(dá)量與生理鹽水組相比無明顯變化。鞘內(nèi)注射AM22-52后，CGRP-IR在大、

15、中、小三種亞型神經(jīng)元中的表達(dá)分布恢復(fù)到了足底注射Saline的水平。 (8)DRG切片經(jīng)nNOS免疫組織化學(xué)染色，在鏡下可見：大、中、小各種類型的感覺神經(jīng)元中均有nNOS-IR，主要集中在神經(jīng)元的核周質(zhì)，核及突起中。足底注射CFA 48h后，DRG神經(jīng)元內(nèi)nNOS-IR的表達(dá)急劇增加，尤其以中、小型細(xì)胞增加最為顯著。鞘內(nèi)注射AM22-52后，nNOS-IR在各型神經(jīng)元中的分布表達(dá)情況與足底Saline組相比無差異。 (9

16、)L5脊神經(jīng)結(jié)扎后，結(jié)扎側(cè)L5 DRG BAM22表達(dá)下調(diào)，與IB4結(jié)合的神經(jīng)元急劇減少。 (10)與Sham組相比，SNL組L4/6DRG中BAM22-IR，IB4+細(xì)胞和雙標(biāo)細(xì)胞都明顯降低了。 結(jié)論： 綜上所述，脊髓背角和DRG中的AM參與了傷害性信息的傳遞，其作用是通過激活A(yù)M受體來實(shí)現(xiàn)的。BAM22可表達(dá)于肽能和非肽能兩類神經(jīng)元中。神經(jīng)結(jié)扎后，結(jié)扎側(cè)DRG神經(jīng)元BAM22表達(dá)下調(diào)，提示內(nèi)源性阿片肽減少，可