提高菜心真空滲入轉(zhuǎn)基因效率的研究.pdf

1、真空滲入作為植物原位轉(zhuǎn)化的一種方法，是白菜類作物中迄今為止所用得最多的不依賴于組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化方法。真空滲入轉(zhuǎn)基因方法在白菜類作物上的應(yīng)用研究雖然已有較多相關(guān)報道，但仍存在一些問題。一方面，真空滲入轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定且普遍較低。另一方面，真空度、滲入時間、植物發(fā)育時期、農(nóng)桿菌濃度、滲入介質(zhì)的表面活性劑與蔗糖含量等條件以及各因素之間的共同作用對植物轉(zhuǎn)化率影響程度尚不明確，使得真空滲入轉(zhuǎn)化技術(shù)難以進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用范圍。
　　本研究以‘油青四九

2、’菜心（Brassica campastris ssp.chinensis var.parachinensis‘Youqing49’）為轉(zhuǎn)基因受體材料，以攜帶有pCAMBIA1301載體的GV3101農(nóng)桿菌為供體材料，針對農(nóng)桿菌菌液OD600、植株發(fā)育時期、壓強(qiáng)與時間、表面活性劑Silwet L-77的濃度及蔗糖濃度對‘油青四九’真空滲入轉(zhuǎn)化率的影響進(jìn)行了單因素研究，分析各因素對轉(zhuǎn)化率的影響。隨后對菌液OD600、壓強(qiáng)與時間、表面活性劑

3、Silwet L-77的濃度及蔗糖濃度進(jìn)行正交實驗設(shè)計，確定菜心真空滲入轉(zhuǎn)化的最佳體系。此外，通過對轉(zhuǎn)基因植株上下部收種和雜交授粉實驗分析原位轉(zhuǎn)化在花序中發(fā)生頻率較高的部位與時間。得到的主要結(jié)果如下:
　　(1)對處于三種不同發(fā)育時期的菜心進(jìn)行真空滲入轉(zhuǎn)化，分析發(fā)育時期對菜心真空滲入轉(zhuǎn)化的影響。其中處理初花期的植株得到了約0.1％的種子轉(zhuǎn)化率，高于處于現(xiàn)蕾期和側(cè)薹初花期的菜心轉(zhuǎn)化率，但三者并沒有顯著差異。處于側(cè)薹發(fā)育期的菜心植株轉(zhuǎn)

4、化率是主薹初花期和蕾期的1.8倍和3倍，表明真空滲入處理菜心的適宜時期是側(cè)薹發(fā)育期。
　　(2)對不同濃度的菌液處理得到的轉(zhuǎn)化率分析結(jié)果表明，菌液濃度對轉(zhuǎn)化事件有顯著影響。在0.0025～0.4000的不同OD600處理中，菌液吸光度值在0.2時獲得了高達(dá)0.12％的種子轉(zhuǎn)化率。
　　(3)對不同壓強(qiáng)和時間處理的轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計結(jié)果表明，壓強(qiáng)與時間對轉(zhuǎn)化效果有極顯著的影響。其中壓強(qiáng)為10 kPa，滲入處理時間為5 min時獲得了最

5、高的轉(zhuǎn)化率。
　　(4)通過對表面活性劑Silwet L-77四種不同濃度的處理，發(fā)現(xiàn)0.0025％，0.005％，0.01％和0.02％的Silwet L-77對菜心真空滲入轉(zhuǎn)化影響顯著，處理菜心最適宜的濃度為0.01％。
　　(5)通過對不同的蔗糖濃度處理獲得轉(zhuǎn)化率的顯著性分析發(fā)現(xiàn)，不同濃度的蔗糖處理得到的轉(zhuǎn)化率差異不顯著。蔗糖含量為3％時可以得到更好的轉(zhuǎn)化效果。
　　(6)對影響菜心真空滲入轉(zhuǎn)化的菌液濃度、滲入時

6、間、轉(zhuǎn)化介質(zhì)中表面活性劑和蔗糖含量進(jìn)行正交實驗設(shè)計，得到適宜菜心真空滲入轉(zhuǎn)化的體系為:菜心處于側(cè)薹初花期，處理壓強(qiáng)10 kPa，滲入時間為5.5 min，菌液吸光度值為0.2，轉(zhuǎn)化介質(zhì)中表面活性劑與蔗糖的含量分別為0.0125％和3％。
　　(7)通過對真空滲入轉(zhuǎn)化菜心植株與野生型植株的不同雜交方式獲得轉(zhuǎn)化率的統(tǒng)計結(jié)果表明，真空滲入處理植株作為父本時，母本為野生型的植株得到了0.0039％種子轉(zhuǎn)化率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于真空滲入處理植株作為母