PDMS微通道內(nèi)金屬微點(diǎn)上DNA固定技術(shù)研究.pdf

1、微流控技術(shù)(microfluidics)由于可望實(shí)現(xiàn)大大降低試劑消耗，縮短反應(yīng)時(shí)間，減少費(fèi)用，眾多的集成潛力，正在成為新一代生物分析技術(shù)的重要推動(dòng)力。結(jié)合微流控的原理與技術(shù)方式是當(dāng)前包括基因芯片在內(nèi)的生物微陣列技術(shù)發(fā)展的一個(gè)重要技術(shù)方向。為了實(shí)現(xiàn)DNA微陣列技術(shù)與微流控方式的融合，將DNA探針固定到微流控芯片的最基本組件——微通道中，是一個(gè)首要的重要步驟。
　　 微通道加工技術(shù)，在常規(guī)上是利用光刻工藝及其隨后興起的軟刻技術(shù)(so

2、ftlithography)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。所以常規(guī)的微陣列與微流控結(jié)合方式，總伴隨著要對(duì)敞開微通道的閉合步驟，這對(duì)許多生物分析步驟帶來(lái)許多不利的后果。
　　 本文在基于軟刻策略的微絲模塑加工微通道的技術(shù)基礎(chǔ)上，通過(guò)十字交叉方式的處理工藝，直接一次成型地在微通道內(nèi)構(gòu)建出金屬微點(diǎn)及其陣列，為克服微陣列與微流控方式結(jié)合中常規(guī)需要作后端閉合處理的缺陷提供了重要條件。本文也由此出發(fā)，討論的重點(diǎn)即是如何在這樣形成的微通道內(nèi)壁的微點(diǎn)上來(lái)實(shí)施DNA

3、探針的固定，并通過(guò)雜交過(guò)程來(lái)檢驗(yàn)固定過(guò)程的可靠性。
　　 微通道內(nèi)DNA固定實(shí)驗(yàn)采取了三種方式：巰基DNA探針與金微點(diǎn)的共價(jià)結(jié)合，DNA探針在微通道內(nèi)作為電極的不銹鋼微點(diǎn)上的吸附，DNA探針在微通道內(nèi)經(jīng)聚吡咯修飾的電極上的固定。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)在微通道內(nèi)的DNA-FAM與金微點(diǎn)上固定經(jīng)過(guò)16小時(shí)的孵育，48小時(shí)固定，隨后與HS-DNA作用5小時(shí)即有肉眼可見的熒光微點(diǎn)出現(xiàn)，這表明在微通道內(nèi)的雜交時(shí)間明顯縮短。(2)

4、在直流電作用下，帶有負(fù)電荷HS-DNA-FAM在微通道內(nèi)不銹鋼微點(diǎn)電極上的吸附?jīng)]有按照預(yù)想情況出現(xiàn)在陽(yáng)極端，相反卻出現(xiàn)在陰極微點(diǎn)表面，由電吸附形成的陰極熒光微點(diǎn)的強(qiáng)度與微點(diǎn)面積大小，DNA濃度，電解質(zhì)濃度，電極之間的距離及通電時(shí)間有關(guān)。①在20微米直徑的微通道中，始終沒(méi)有出現(xiàn)可見的熒光微點(diǎn)，40，60，80，100μm不銹鋼絲交叉點(diǎn)的面積與陰極電極吸附的DNA的熒光強(qiáng)度成正比。②在其他條件恒定的情況下，隨著DNA濃度在0.00305-1

5、2.5nmol/ml之間逐漸增加時(shí)，不銹鋼微點(diǎn)上電吸附的ssDNA微點(diǎn)熒光強(qiáng)度在持續(xù)增大，但是在大于0.78125nmol/ml后影響微小。當(dāng)DNA濃度在0.00305nmol/ml時(shí)由于DNA濃度過(guò)小，難以在較短時(shí)間內(nèi)在不銹鋼微點(diǎn)上形成有效地肉眼可見的DNA熒光微點(diǎn)。③在其他條件恒定的情況下NaCL濃度在0.063-0.25mol/L之間逐漸增加時(shí)，不銹鋼微點(diǎn)上電吸附的ssDNA微點(diǎn)熒光強(qiáng)度在持續(xù)增大，但是在大于0.25mol/L后影

6、響微小。當(dāng)NaCL濃度在0.063mol/L時(shí)，難以在50s在不銹鋼微點(diǎn)上形成有效地肉眼可見的DNA熒光。④在其他條件恒定的情況下，電極間距逐漸增加時(shí)，不銹鋼微點(diǎn)上電吸附的ssDNA微點(diǎn)熒光強(qiáng)度不斷持續(xù)減小，電極間距逐大于520微米后在不銹鋼微點(diǎn)上難以形成有效的肉眼可見的DNA熒光微點(diǎn)。⑤在其他條件恒定的情況下，隨著通電時(shí)間在0-200s之間逐漸增加時(shí)，不銹鋼微點(diǎn)上電吸附的ssDNA微點(diǎn)熒光強(qiáng)度在持續(xù)增大。在可控的第6秒時(shí)，即有可見熒光

7、微點(diǎn)出現(xiàn)，但是在大于100s后熒光強(qiáng)度變化影響微小。(3)在微通道內(nèi)的不銹鋼微點(diǎn)表面鋪上一層無(wú)交聯(lián)劑的PDMS后，通過(guò)電化學(xué)方法把(10個(gè)伏安循環(huán)，20分鐘)聚吡咯修飾在微點(diǎn)表面，同時(shí)固定靶DNA，隨后進(jìn)行溫度差異，及雜交與非雜交過(guò)程導(dǎo)致的伏安循環(huán)電流變化(10個(gè)伏安循環(huán)，20分鐘)，結(jié)果顯示在最適溫度條件下，其電流信號(hào)增大了32.03倍，而在室溫條件下僅增大了3.51倍；有雜交行為出現(xiàn)時(shí)，其電流信號(hào)較基礎(chǔ)電流凈增大了127.273倍；

8、而無(wú)雜交行為出現(xiàn)時(shí)，其電流信號(hào)較基礎(chǔ)電流僅僅凈增大了21.4倍。
　　 在三種實(shí)驗(yàn)比較中，在微通道內(nèi)在金微點(diǎn)表面DNA固定時(shí)間最長(zhǎng)，與互補(bǔ)鏈雜交的形成所需時(shí)間也最長(zhǎng)，但是仍舊比在開放液池條件下雜交要快得多。在電吸附試驗(yàn)中，F(xiàn)AM-DNA-HS在最短可控的第6秒既有可見熒光微點(diǎn)出現(xiàn)，但是需要用直流電維持，并且對(duì)其后的雜交試驗(yàn)造成了不利影響。在通過(guò)聚吡咯固定DNA所需時(shí)間介于以上兩種試驗(yàn)之間，也僅需20分鐘，雜交時(shí)間僅20分鐘，速度