PAK1在大腸癌演進(jìn)和轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、背景與目的 大腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是常見的惡性腫瘤，全球每年新增病例近 1000000例，492000例死亡。隨著經(jīng)濟(jì)的進(jìn)步，生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的變化，我國大腸癌每年發(fā)病率也快速遞增，特別是大城市上升趨勢更為顯著。大腸癌男女發(fā)病率等同，在40歲以后發(fā)病危險(xiǎn)度隨著年齡增加而遞增；資料顯示我國大腸癌男性發(fā)病率約為16.2/100000，女性約為14.5/100000，大腸癌已經(jīng)成為我國致死性腫瘤中

2、最常見的死亡原因之一。然而，大腸癌的治療效果并不理想，在所有的病人中約有半數(shù)患者治療失敗。大腸癌傳統(tǒng)治療方法，即外科手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)藥物治療方法的不斷發(fā)展和完善，在延長患者生存期和提高患者生存質(zhì)量方面取得了長足的進(jìn)步；但是手術(shù)和放療是局部治療，難以控制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，化療藥物往往缺乏組織選擇性和特異性，對骨髓等正常人體重要器官和組織產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，在過去幾十年，大腸癌的五年生存率一直徘徊在40～50％左右。因此，探尋大腸上

3、皮細(xì)胞癌變，演化和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，特別是尋找早期腫瘤標(biāo)志物，以期早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)大腸癌的生物學(xué)進(jìn)程，對大腸癌的治療具有重要的意義。 p21-activated kinase-1(PAKl)即p21小GTP酶活化激酶1，是第一個(gè)被克隆和驗(yàn)證的的絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸化激酶家族成員。PAK是分子量為21KD、Rho家族的小GTP酶(small GTPases)，即Cdc42和Rac的下游效應(yīng)分子。在分子結(jié)構(gòu)上，PAK N-末端為激酶的調(diào)

4、節(jié)區(qū)，C-末端為激酶的底物結(jié)合區(qū)，具有激酶活性。PAK1-3構(gòu)成第一組PAK，分子量為62-64 KD，其激活需要Cdc42和Rac，除調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、正常的細(xì)胞生長，分化和凋亡外，PAK家族成員還在人類疾病中起重要作用。PAK1是PAK家族中與人類腫瘤關(guān)系密切的成員，其在細(xì)胞骨架修復(fù)、延長正常細(xì)胞壽命和正向調(diào)節(jié)一些正常生理代謝等方面都起重要作用。PAKl只在腦、肌肉和脾臟正常組織表達(dá)，其他組織表達(dá)很少，但在很多人類腫瘤細(xì)胞都高表達(dá)PAK

5、l，尤其是在乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞中PAKl的表達(dá)遠(yuǎn)高于其它腫瘤細(xì)胞，而且PAKl表達(dá)與乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。但PAKl在大腸癌的發(fā)生發(fā)展、演化和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚未明確，因此本課題在系統(tǒng)地檢測PAKl在大腸癌旁正常組織一息肉一腺瘤一原發(fā)性大腸癌組織一大腸癌轉(zhuǎn)移癌瘤組織中的表達(dá)差異和分布特點(diǎn)基礎(chǔ)上，同時(shí)構(gòu)建PAKl真核表達(dá)載體和PAKl shRNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染大腸癌SW480細(xì)胞，觀察上調(diào)和下調(diào)大腸癌細(xì)胞PAKl

6、表達(dá)后對大腸癌細(xì)胞增殖、凋亡，細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)、侵襲和致瘤等表型的改變，以期深入了解PAKl在大腸癌細(xì)胞演化和轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制，并探討PAKl作為大腸癌轉(zhuǎn)移標(biāo)志和作為潛在治療靶點(diǎn)的可能性。 材料與方法 一、PAKl在良、惡性大腸病變中的表達(dá)及其臨床意義用免疫組織化學(xué)S-P法檢測PAKl在大腸癌癌旁正常粘膜、大腸息肉、大腸良性腺瘤、大腸癌和大腸癌轉(zhuǎn)移瘤組織中的表達(dá)，并分析PAKl表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系。 二

7、、PAKl對大腸癌細(xì)胞表型的影響為檢測PAKl對大腸癌細(xì)胞增殖、粘附、移動(dòng)和侵襲等表型的影響，利用基因重組技術(shù)分別構(gòu)建PAKl真核表達(dá)載體和PAKl shRNA真核表達(dá)載體(RNA interference,RNAi)，并以大腸癌細(xì)胞SW480作為模型，轉(zhuǎn)染重組載體后觀測對大腸癌SW480細(xì)胞表型的影響，并分析PAKl在大腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用及其可能機(jī)制。 1、PAKl真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建按照Genbank上公布的PA

8、Kl mRNA序列(NM 002576)，在其編碼區(qū)(CDS)設(shè)計(jì)兩端帶有EcoRI和BamH I酶切位點(diǎn)的引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增PAKl CDS區(qū)，EcoRI和BamH I雙酶切純化的PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pEGFP/C1，T<,4>連接酶連接酶切純化后的PCR產(chǎn)物和酶切純化后的pEGFP/C1，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，挑單菌落培養(yǎng)擴(kuò)增，提取重組質(zhì)粒后行EcoRI

9、和BamH I雙酶切鑒定，選擇插入片段正確的克隆測序鑒定。 2、PAKl shRNA重組載體的構(gòu)建根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)的原則，在PAKl mRNA(NM 002576)CDS設(shè)計(jì)三對siRNA核苷酸序列，并設(shè)計(jì)一對非相關(guān)核苷酸序列作為對照，經(jīng)Genbank在線BLAST確定確定與其它人類基因無高度同源后，分布在所設(shè)計(jì)的siRNA兩端分別加上帶有BamH I和EcoRI酶切位點(diǎn)的 shRNAs(shott hairpin RNAs)

10、單鏈送公司合成，配對單鏈核苷酸退火復(fù)性合成雙鏈，按常規(guī)操作把shRNA序列克隆到pRNAT-U6.1/Neo載體中，重組質(zhì)粒酶切和測序鑒定。 3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞和建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆采用Invintrogen公司的Lipofectamine 2000<'TM>脂質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后用分別用80μg/ml G418篩選陽性細(xì)胞克隆，挑取單克隆細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)。 4、PAKl表達(dá)調(diào)控效應(yīng)檢測逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)fReve

11、rse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫印跡、免疫細(xì)胞化學(xué)與激光共聚焦顯微鏡檢測PAKl mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)改變。 5、細(xì)胞增殖與凋亡MTT法檢測PAKl對大腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響；采用DNA片段法檢測PAKl對5-Fu誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。 6、細(xì)胞基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)的方法研究PAKl對大腸癌細(xì)胞SW480粘附的影響。 7、單層細(xì)

12、胞劃痕愈傷實(shí)驗(yàn)分析單層細(xì)胞劃痕愈傷實(shí)驗(yàn)分析PAKl對大腸癌細(xì)胞移行的影響，參照文獻(xiàn)操作。 8、侵襲實(shí)驗(yàn)觀察改變PAKl表達(dá)對大腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響。 9、軟瓊脂糖集落形成實(shí)驗(yàn)觀察RNAi沉默PAKl表達(dá)對SW480細(xì)胞錨著獨(dú)立性生長的影響。 10．明膠酶譜實(shí)驗(yàn)觀測PAKl對SW480細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白分泌和活性的影響。 11、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察PAKl表達(dá)對SW480細(xì)胞裸鼠成瘤的影響，包括成瘤瘤體大小、侵

13、襲轉(zhuǎn)移部位差異。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所得數(shù)據(jù)用SPSSl2.0 for Windows軟件，免疫組織化學(xué)采用等級資料多個(gè)獨(dú)立樣本和兩個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)；其它數(shù)據(jù)行單向方差分析(One-Way ANOVA)，組間多重比較用LSD方法進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，以P≤0.05為有顯著性差異。 結(jié)果 1、PAKl在良、惡性大腸病變中的表達(dá)及其臨床意義免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果表明PAKl主要在細(xì)胞胞漿表達(dá)，

14、胞核偶有少量表達(dá)，而在大腸上皮細(xì)胞外基質(zhì)中基本不表達(dá)。 2．PAKl shRNA真核表達(dá)載體經(jīng)酶切和測序證實(shí)插入序列與設(shè)計(jì)序列完全一致； 3、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480經(jīng)G418抗性篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞克隆株； 4、與對照細(xì)胞比較，RT-PCR和Western blotting從mRNA和蛋白水平證實(shí)SW480內(nèi)源性PAKl被PAKl shRNA抑制； 5、選取PAKl shRNA中一個(gè)克隆細(xì)胞株用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并

15、把其細(xì)胞克隆命名為 SW480<'shRNAl>，非相關(guān)序列細(xì)胞克隆命名為SW480<'shRNA-N>;PAKl真核載體細(xì)胞克隆株命名為Sw480<'PAKl>，pEGFP/C1質(zhì)粒對照細(xì)胞克隆命名為SW480<'svector>； 6、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，在各組細(xì)胞孵育24h后，各組細(xì)胞間增殖有顯著性差異； 8、細(xì)胞-基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組細(xì)胞之間粘附細(xì)胞明顯不同，8W480<'shRNAl>細(xì)胞顯著減少，與SW48

16、0細(xì)胞相比(P=0.015)和與SW480<'shRNA-N>相比較P=0.018)，而SW480細(xì)胞與SW480<'shRNA-N>細(xì)胞之間比較無顯著性差異；SW480<'PAKl>與SW480相比(P=0.004)和與SW480<'vector>相比(P=0.004)，細(xì)胞粘附顯著增加。 9通過軟瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)可以觀察細(xì)胞錨定獨(dú)立性生長的能力，從而反映細(xì)胞的惡性程度。 結(jié)論 1、免疫組織化學(xué)檢測顯示PAK

17、l表達(dá)從腺瘤到腫瘤、從原發(fā)大腸癌到轉(zhuǎn)移大腸癌依次增加，提示PAKl在大腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。 2、上調(diào)PAKl表達(dá)可以促進(jìn)大腸癌細(xì)胞SW480增殖，下調(diào)PAKl表達(dá)則可以抑制大腸癌細(xì)胞SW480的增殖； 3、PAKl可以增強(qiáng)大腸癌細(xì)胞的異質(zhì)粘附，下調(diào)PAKl表達(dá)則抑制SW480細(xì)胞的異質(zhì)粘附； 4、PAKl增強(qiáng)大腸癌細(xì)胞的非錨定式依賴式生長，下調(diào)PAKl表達(dá)則抑制大腸癌細(xì)胞的集落形成能力； 5