長期多代飲奶對鼠小腸乳糖酶活性及mRNA水平的影響研究.pdf

1、世界范圍內(nèi)大多數(shù)無飲奶傳統(tǒng)種族在其斷奶1～2年以后，腸道乳糖酶都會(huì)逐漸下降到一個(gè)較低水平，并且維持終生，即發(fā)生成人型乳糖不耐受(adult-typehypolactasia)。乳糖不耐受的發(fā)生有多種危害，除了影響乳品中Ca，P,Mg等的吸收利用外，還可直接導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。目前對于乳糖不耐受的研究很多，但其發(fā)生機(jī)制仍不很清楚，而且多選用豬、狗、家兔、大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。為了通過多代繁殖實(shí)驗(yàn)，來探討乳糖不耐受的機(jī)制，我們首次選用了繁殖周期

2、相對較短、遺傳背景均一的近交系BALB/c小鼠作為繁殖實(shí)驗(yàn)的研究對象，并對這一品系小鼠乳糖酶的編碼基因進(jìn)行了初步研究。 本文做了以下四部分的工作：1BALB/c小鼠乳糖酶基因Lac的克隆及序列分析1.1方法1.1.1BALB/c小鼠乳糖酶基因的克?。喝?周齡BALB/c小鼠空腸段小腸組織，提取組織總RNA，以人和大鼠乳糖酶基因?yàn)閰⒖?，利用生物學(xué)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)特異PCR引物，逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA第一鏈，梯度PCR擴(kuò)增小

3、鼠乳糖酶編碼基因。 1.1.2pNEB-Lac重組質(zhì)粒的構(gòu)建：PCR產(chǎn)物和克隆載體pNEB193分別經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶消化，DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)入E.coliTB1感受態(tài)細(xì)胞，重組子經(jīng)篩選和鑒定后對插入的目的基因進(jìn)行測序，測序結(jié)果提交GenBank核酸數(shù)據(jù)庫。 1.1.3BALB/c小鼠乳糖酶基因的序列分析：利用NCBIBLAST，Omiga2.0等生物學(xué)軟件對克隆基因的性質(zhì)及功能進(jìn)行分析預(yù)測。

4、1.2結(jié)果1.2.1本研究克隆的BALB/c小鼠乳糖酶基因Lac編碼區(qū)共有912bp，起始密碼為ATG，編碼303個(gè)氨基酸殘基。 1.2.2序列已提交NCBIGenBank，登錄號AY751548。1.2.3經(jīng)預(yù)測，所編碼的蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)如下：蛋白：乳糖酶；長度：303aa；分子量：34.113KDa；等電點(diǎn)(pI)：8.676等。 1.2.4所編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)中，存在一個(gè)糖苷鍵水解酶F1，該基序位于N端121-12

5、9位氨基酸之間，其氨基酸序列為IYVTENGVS。 1.2.5在酶蛋白的C末端存在一個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，這一預(yù)測與文獻(xiàn)報(bào)道人的乳糖酶通過C末端的跨膜肽段錨定在小腸微絨毛刷狀緣結(jié)果相一致。證明我們克隆的基因結(jié)構(gòu)和功能與人的乳糖酶相同。 1.2.6BALB/c小鼠乳糖酶基因Lac與C57BL/6J小鼠的XM1294793序列同源性為99％，與大鼠LctcDNA序列同源性為88-89％，與人LctcDNA同源性為83％。

6、1.3結(jié)論1.3.1成功克隆BALB/c小鼠乳糖酶cDNALac； 1.3.2成功構(gòu)建BALB/c小鼠乳糖酶編碼基因Lac克隆載體pNEB-Lac。 1.3.3小鼠乳糖酶基因在人和大鼠基因組中具有同源序列。 2小鼠乳糖酶cDNA探針標(biāo)記及酶活性測定方法的研究2.1材料與方法2.1.1標(biāo)記用cDNA來自第一部分克隆的小鼠乳糖酶編碼基因并經(jīng)BamHⅠ內(nèi)切酶水解后得到的318bp保守核酸片段。 2.1.2采用隨

7、機(jī)引物法地高辛標(biāo)記LaccDNA探針。標(biāo)記用試劑盒為德國Roche公司的“隨機(jī)引物DigHighPrimeDNALabelingangDetectionStarterKit1”。 2.1.3探針靈敏度檢測用武漢博士德公司產(chǎn)的敏感性加強(qiáng)型原位雜交檢測試劑盒。 2.1.4乳糖酶測定方法在Dahlqvist方法基礎(chǔ)上改良。 2.2結(jié)果2.2.1經(jīng)檢測標(biāo)記探針靈敏度達(dá)到0.1pg。 2.2.2乳糖酶測定最適的底物

8、溶液pH值為4.6(小鼠)，5.6(大鼠)。反應(yīng)的最佳條件為：水浴反應(yīng)75min，顯色45min，顯色劑(TGO)用量為3.0ml。 2.3結(jié)論2.3.1本部分標(biāo)記的核酸分子探針具有較高的靈敏度。 2.3.2本研究建立的小鼠乳糖酶測定方法具有很好的精確度和重復(fù)性。 3長期多代飲奶對BALB/c小鼠小腸黏膜乳糖酶活性的影響3.1目的通過多代繁殖實(shí)驗(yàn)探討長期不間斷飲奶對小鼠小腸黏膜乳糖酶活性的影響，以及可能的分子機(jī)制

9、。 3.2方法按第二部分執(zhí)行，其中，mRNA采用原位雜交測定，分析采用半定量法(灰度分析)。 3.3結(jié)果3.3.1無論在斷奶組或飲奶組，原代不同年齡段小鼠小腸黏膜乳糖酶活性均不同，其中3wk齡鼠乳糖酶活性最高，5、7wk齡顯著下降，9wk齡最低，說明小鼠在斷乳后，乳糖酶活性隨年齡增大而明顯下降。 3.3.2子一代小鼠與原代相似，均呈現(xiàn)成年后乳糖酶活性下降的現(xiàn)象；且相同年齡組兩代之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，斷奶組或飲奶組之間

10、也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.3.3子二代7wk齡小鼠乳糖酶活性與斷乳前小鼠(3wk)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而與7wk齡斷奶組、原代7wk齡飲奶組都出現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p＜0.05，說明三代長期飲奶能使子二代7wk齡小鼠乳糖酶活性維持在一定水平。 3.3.4原位雜交后經(jīng)灰度分析發(fā)現(xiàn)，各代、各組間，乳糖酶mRNA水平未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.3.5從細(xì)胞圖譜看，小鼠乳糖酶mRNA存在于小腸絨毛底部，沿腸線(隱窩軸)分布。 3.

11、4結(jié)論34.1通過多代不間斷飲奶，對維持乳糖酶活性有益。 3.4.2乳糖酶基因的調(diào)控，可能發(fā)生在翻譯水平或后翻譯水平，而并非在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)。也就是說，乳糖酶基因在轉(zhuǎn)錄了高量的mRNA后，在由mRNA向乳糖酶蛋白翻譯的過程，或者由乳糖酶蛋白前體向乳糖酶的活性形式轉(zhuǎn)變的過程中，出現(xiàn)了下調(diào)機(jī)制。 3.4.3由于本研究繁殖動(dòng)物的代數(shù)不夠多，因此，是否在4、5、6……代之后，會(huì)出現(xiàn)其他的情況，如乳糖酶mRNA水平有了某種變化，而

12、這種變化的意義是什么，還有待于今后的研究。 4SD大鼠乳糖酶在小腸中分布情況的研究4.1材料與方法選3-4wk齡SD大鼠15只，自十二指腸下連續(xù)剪取三段，每段約10cm，分別測定乳糖酶活性及乳糖酶mRNA水平。 4.2結(jié)果4.2.1乳糖酶活性結(jié)果，經(jīng)方差分析，三段之間存在差異，說明從十二指腸起，小腸乳糖酶活性逐段降低?？上樘堑娜樘敲笐?yīng)主要分布在小腸上段。 4.2.2三組間，乳糖酶mRNA水平未出現(xiàn)差異。

13、 4.2.3從細(xì)胞圖譜看，SD大鼠乳糖酶mRNA除主要沿腸線分布外，腸絨毛上也有不少散在的分布。 4.3結(jié)論本部分結(jié)果顯示，乳糖酶的消化應(yīng)在小腸上段。而mRNA水平未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，進(jìn)一步佐證了第三部分的結(jié)論，即乳糖酶基因的調(diào)控可能發(fā)生在翻譯或后翻譯階段。 總結(jié)本研究首次選用近交系小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究乳糖不耐受的調(diào)控機(jī)制，成功克隆了BALB/c小鼠乳糖酶編碼基因Lac，并構(gòu)建5pNEB-Lac重組載體。利用生物信息學(xué)